Master's Thesis

The Effect of Faradaic Charge-Transfer Reactions on Cell Permeabilization and Viability During Electroporation

Final Thesis 14.44 MB

Author of thesis: Bc. Dominik Martinů

Acad. year: 2025/2026

Supervisor: prof. Eric Daniel Glowacki, Ph.D.

Reviewer: Prof. Andrei Pakhomov

Abstract:

Electroporation utilizes high-intensity voltage pulses to permeabilize the cell membranes, serving as a staple technique across biotechnology and medicine. While the primary mechanism – pore formation due to the electric field – is well-established, a significant discrepancy remains between theoretical models and experimental observations: molecular dynamics (MD) simulations predict pore closure within nanoseconds, yet experimental permeabilization can persist for minutes. This prolonged post-pulse state suggests that secondary effects, such as electrochemically generated reactive oxygen species (ROS), may play a critical role. This study investigates the impact of electrode surface properties on the electroporation efficiency and viability of CHO-K1 cells. Three distinct electrode configurations were evaluated: conventional metal, anodized metal-oxide (to suppress electrochemistry), and activated electrodes (optimized to enhance the oxygen reduction reaction and H2O2 formation). Methodologically, H2O2 generation, pore closure kinetics, and cell viability were assessed. Crucially, real-time voltage and current transients were recorded to calculate the actual electric field strength delivered to the biological load. Results demonstrate that while different electrode materials exhibit varied ROS generation, both membrane permeabilization and cell viability correlate strictly with the actual delivered electric field, rather than the electrochemical effects. Because the physical properties of the electrodes dictate the total injected current, identical nominally applied voltages yield significantly different actual electric fields depending on the material used. Therefore, the common assumption that nominal applied voltage directly determines the electric field is an oversimplification. Consequently, previous studies comparing electroporation experiments based purely on nominal voltage are flawed. While the biological impacts of ROS warrant further investigation, this study establishes that standardizing electroporation protocols to the calculated, actual electric field is an absolute necessity for valid cross-study comparisons.

Keywords:

Electroporation, CHO cells, Electrode materials, Reactive Oxygen Species (ROS), Permeabilization efficiency, Cell viability

Date of defence

26.05.2026

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaAznamka

Grading

A

Process of defence

1. Student seznámil členy komise s náplní a cílem diplomové práce. 2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci. 3. Student akceptoval všechny připomínky oponenta a na všechny otázky odpověděl v plné šíři. Diskuse: prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. Jaké buňky jste v experimentu používal? Na základě jakých parametrů byly buňky vybrány? V čem se liší klasický elektroporátor, který se využívá k vytvoření rekombinantních kmenů, s Vaším testovaným přístrojem? Jaký je hlavní důvod vývoje Vašeho přístroje? prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. Podle jakých parametru jste vybírali materiál pro elektrody? Za jakým účelem dochází k modifikaci elektrod? V práci uvádíte větší množství přístrojů, můžete to prosím objasnit? doc. Mgr. Pavel Dvořák, Ph.D. Můžete popsat mechanismus, co se děje s membránou při elektroporaci? Zmínil jste hydrofilní pór, můžete to objasnit? Jaký typ buněk využíváte? Student odpověděl na všechny doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. V diskusi student prokázal výbornou orientaci v dané problematice. Po diskusi následovalo hodnocení závěrečné práce. Diplomant prokázal nejen výborné odborné znalosti, ale i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.

Language of thesis

English

Faculty

Department

Study programme

Chemistry for Medical Application (NPCP_CHMA)

Specialization

Chemistry of Bioactive Substances (CHBL)

Composition of Committee

prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
doc. Ing. Petr Sedláček, Ph.D. (místopředseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
doc. Mgr. Pavel Dvořák, Ph.D. (člen)

Supervisor’s report
prof. Eric Daniel Glowacki, Ph.D.

Práce se zabývá aktuálním a vědecky významným tématem vlivu faradaických přenosů náboje, reaktivních forem kyslíku a vlastností elektrod na permeabilizaci a viabilitu buněk při elektroporaci. Cíle práce zahrnovaly přípravu a charakterizaci různých elektrodových materiálů, kvantifikaci tvorby H₂O₂, měření proudových a napěťových transientů a biologické experimenty na buňkách CHO.

Student během řešení práce prokázal samostatnost, iniciativu a vědeckou vyspělost. Úspěšně získal financování Erasmus+ pro výjezd do skupiny prof. Lei Rems na University of Ljubljana ve Slovinsku, kde realizoval významnou část experimentální práce. Během pobytu si osvojil nové měřicí a experimentální techniky, které následně začal zavádět také v našich laboratořích v Brně. Současně se aktivně zapojil do konsorciálního výzkumného projektu financovaného AZV, řešeného ve spolupráci VUT a ÚFE AV ČR v Praze, zaměřeného na elektroporaci. Za zmínku stojí také skutečnost, že student úspěšně získal cestovní grant Bioelectromagnetics Society pro cestu do USA po dokončení diplomové práce.


Odborná úroveň práce je vysoká a odpovídá úrovni nejlepších diplomových studentů. Teoretická část je zpracována pečlivě, přehledně a s výbornou orientací v literatuře. Experimentální část přináší kvalitní a vědecky relevantní výsledky, zejména z hlediska korelace biologických účinků elektroporace se skutečně dodaným elektrickým polem, nikoliv pouze s nominálně aplikovaným napětím, což je jeden z klíčových závěrů práce. Výsledky představují významnou část připravovaného vědeckého článku, ve kterém bude student prvním autorem.

Jedinou výhradou je skutečnost, že zejména výsledková část byla finalizována ve spěchu krátce před termínem odevzdání. To se místy projevuje menší pozorností k detailům, než by si velmi kvalitní experimentální výsledky zasloužily. Tato skutečnost však nesnižuje celkově vysokou odbornou úroveň DP ani význam dosažených výsledků.

Celkově hodnotím DP Bc. Dominika Martinů jako výbornou. Student prokázal vysokou míru samostatnosti, schopnost řešit náročné experimentální úkoly, aktivně vyhledávat mezinárodní spolupráci a pracovat na úrovni začínajícího vědeckého pracovníka.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Studium literatury a její zpracování A
Využití poznatků z literatury A
Kvalita zpracování výsledků B
Interpretace výsledků, jejich diskuse B
Závěry práce a jejich formulace A
Využívání konzultací při řešení práce B
Celkový přístup k řešení úkolů A

Grade proposed by supervisor: A

Reviewer’s report
Prof. Andrei Pakhomov

The thesis is exceptionally strong for a Master’s thesis and fully meets the requirements of the
assignment. It provides a broad and well-informed review of electroporation, electrode
electrochemistry, reactive species, and biological effects, followed by a substantial experimental
study comparing different electrode materials and surface modifications. The work includes cell
permeabilization and viability assays, hydrogen peroxide measurements, impedance analysis, and
voltage/current transient recordings, all of which are directly relevant to the stated objectives.
The thesis is logically organized and easy to follow. The theoretical part gives sufficient
background for the experimental work, and the results are presented in a clear sequence from
electrode characterization to biological outcomes. The figures and data presentation are generally
very good. A particularly strong aspect is the attention to the actual delivered electrical conditions
rather than relying only on nominal applied voltage.
The interpretation of the results is thoughtful and scientifically mature. The author convincingly
shows that permeabilization and viability correlate primarily with the delivered electric
field/current conditions, while electrode-dependent ROS generation appears less predictive under
the tested conditions. This is an important conclusion and is well supported by the data.
In future, it would be valuable in to examine more explicitly how inter-electrode distance, sample
volume, and the distance of cells from the electrode surfaces influence exposure to short-lived
electrochemical products. ROS, reactive chlorine species, pH shifts, and metal ions are likely
generated locally at the electrode interface and may form gradients not fully reflected by bulk
measurements. Similarly, the changing state of electrodes during repeated pulse exposure
deserves further attention. These points do not call for correction or amendment of the present
thesis; rather, they highlight the complexity the research direction and identify future avenues to
pursue.
The literature review is strong, extensive, and well integrated into the discussion. The language is
clear and professional.
The formal quality of the thesis is high, and the overall impression is very positive.
The conclusions are clearly formulated and consistent with the results. Overall, this is an
ambitious, well-executed, and scientifically valuable thesis. I recommend it for acceptance and
for the award of the Master’s degree.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Logické členění práce A
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse B
Využití literatury a její citace A
Úroveň jazykového zpracování A
Formální úroveň práce – celkový dojem A
Závěry práce a jejich formulace A
Topics for thesis defence:
  1. 1/ What was the inter-electrode dsitance and how exactly did you calculate teh electric field in the medium?
  2. 2/ How uniform the electric field was?

Grade proposed by reviewer: A

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová