Bachelor's Thesis

Applications of Fluorescence Holographic Microscope

Final Thesis 8.25 MB Final Thesis 6.93 MB

Author of thesis: Ing. Evžen Zobač

Acad. year: 2013/2014

Supervisor: Ing. Pavel Kolman, Ph.D.

Reviewer: Ing. Zbyněk Dostál, Ph.D.

Abstract:

This bacherol thesis discusses the holographic fluorescence microscopy, interferometric microscope with off-axis interference.
It is divided into a theoretical part and an experimental part. The theoretical part describes the setting of the holographic fluorescent microscope and basic theory of fluorescence interferometry. There are also described the methods used to increase the resolution of fluorescence microscopy.
The practical part deals with the verification of the imaging properties of holographic fluorescence microscope and opportunities for enhanced imaging features and measurements.

Keywords:

Fluorescent holographic microscope, fluorescence interferometry, 4Pi, I5M, SIM, STED

Date of defence

26.06.2014

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaDznamka

Grading

D

Language of thesis

Czech

Faculty

Department

Study programme

Applied Sciences in Engineering (B3901-3)

Field of study

Physical Engineering and Nanotechnology (B-FIN)

Composition of Committee

prof. RNDr. Tomáš Šikola, CSc. (předseda)
prof. RNDr. Miroslav Liška, DrSc. (místopředseda)
prof. RNDr. Bohumila Lencová, CSc. (člen)
prof. RNDr. Jiří Komrska, CSc. (člen)
prof. RNDr. Petr Dub, CSc. (člen)
prof. RNDr. Radim Chmelík, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Jiří Spousta, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Ivan Křupka, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Pavel Zemánek, Ph.D. (člen)
RNDr. Antonín Fejfar, CSc. (člen)

Supervisor’s report
Ing. Pavel Kolman, Ph.D.

Práce nazvaná Použití fluorescenčního holografického mikroskopu je rozdělena do čtyř kapitol. První kapitola je úvodní, stručně (na jedné straně textu) pojednává o historii fluorescenční mikroskopie a holografie, ke konci se zmiňuje o fluorescenční interferometrii. Druhá kapitola nazvaná Fluorescenční holografický mikroskop velmi stručně (na jedné straně textu) popisuje vyvinuté zařízení. Jelikož jde o stěžejní téma celé práce, měl by být popisu zařízení věnován odpovídající prostor. Popis by měl být srozumitelný i pro čtenáře neznalého souvislostí (např. str. 5: "V roce 2009 byl v optické laboratoři ústavu fyzikálního inženýrství sestrojen holografický mikroskop s novým uspořádáním difrakční mřížky. Mřížka již není použita jako dělič paprsku, přesunula se do jedné z větví do roviny sdružené s předmětovou rovinou."). Třetí kapitola nazvaná Fluorescenční interferenční mikroskopie má sedm stran a podává stručný přehled o technikách zvyšujících rozlišení ve fluorescenčním zobrazení. Měla by předcházet Kapitolu 2. Jako úvodní přehled technik je dobře zpracovaná, čerpá z citované literatury. Místy by bylo vhodné podrobněji vysvětlit princip (např. str. 15, odst. 3.5: "Tato technika funguje na principu snímání devíti 2D obrazů (pocházejících z různých rovin vzorku) pomocí sady čoček. Kombinací těchto obrazů vzniká výsledný 3D obraz vzorku."). Dále by měla následovat kapitola, věnující se prvnímu úkolu, tj. rešerši k tématu fluorescenční interferenční mikroskopie. Tím bylo myšleno vyhledat a prostudovat odborné publikace a zpracovat přehled současného stavu poznání. Úkol byl splněn pouze částečně, a to v odstavcích 3.3 až 3.5, kde je uveden stručný souhrn základních informací. Druhým úkolem bylo (na základě poznatků z literatury) navrhnout, opatřit a proměřit vhodné testovací vzorky a výsledky porovnat s publikovanými experimenty. Tomuto úkolu se na čtyřech stranách věnuje čtvrtá kapitola. Byly vyrobeny jednoduché testovací vzorky (tenká vrstva fluoreskujících PS kuliček, tlustá vrstva fluorescenčního roztoku), ale experiment se nezdařil. Následně měl být připraven a proměřen vzorek o více vrstvách - to nebylo provedeno. Jelikož se nepovedly experimenty, nemohl být řádně splněn třetí úkol. V závěru čtvrté kapitoly jsou slovně navrženy konstrukční úpravy, které však mohly být provedeny v rámci této práce (alespoň uchycení kostek s fluorescenčními filtry). Vlastní tvorbu tedy práce neobsahuje. Práce je celkově stručná, množství překlepů a chyb by mělo být menší. Digitální verze práce zabírá 8,7 MB, což neodpovídá množství využitelných informací v práci obsažených. Vzhledem k dostatku času z důvodu opakování třetího ročníku a vzhledem k úvazku na projektu týkajícím se realizace fluorescenčního holografického mikroskopu jsem očekával mnohem lepší výsledek. Pochválit lze praktickou zručnost při seřizování mikroskopu, přípravě vzorků a při měření.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků a cílů zadání E
Postup a rozsah řešení, adekvátnost použitých metod C
Vlastní přínos a originalita D
Schopnost interpretovat dosažené vysledky a vyvozovat z nich závěry C
Využitelnost výsledků v praxi nebo teorii C
Logické uspořádání práce a formální náležitosti C
Grafická, stylistická úprava a pravopis C
Práce s literaturou včetně citací B
Samostatnost studenta při zpracování tématu D

Grade proposed by supervisor: D

Reviewer’s report
Ing. Zbyněk Dostál, Ph.D.

Bakalářská práce Evžena Zobače se věnuje rešerši literatury na téma fluorescenční interferometrie, výběru a testování vhodných vzorků pro stanovení rozlišení fluorescenčního holografického mikroskopu (FHM). Dílo je členěno do čtyř kapitol, které jsou dělené na menší logické celky. V prvé je v krátkosti popsána historie fluorescenční mikroskopie a holografie. Druhá kapitola popisuje fluorescenční holografický mikroskop. Je zmíněno optické schéma laboratorní sestavy, popsány jeho vlastnosti a uveden seznam použitých dílů. Rešerše stávajících fluorescenčních interferenčních mikroskopových sestav je uvedena v třetí kapitole. Je zde také popsána rozptylová funkce mikroskopu a možnosti zvýšení rozlišovací schopnosti ve fluorescenční mikroskopii. V poslední kapitole jsou popsány experimenty k ověření zobrazovacích schopností FHM. Student vybral z literatury dva typy vzorků, které vyrobil a zkusil otestovat. Z provedených experimentů vyvodil návrhy úprav sestavy FHM tak, aby byly v budoucnu experimenty úspěšné. Práci bohužel kazí velké množství nedodělků a chyb. Uvedu jen ty nejvýznamnější. Část práce s rešerší je velmi stručná, jednotlivé metody jsou velmi zajímavé a zaslouží si podrobnější popis. U většiny vzorců nejsou všechny veličiny popsány v textech. U obrázku 2.1 nesouhlasí popisky s textem (Z a ZD) nebo chybí (ZR) a také je matoucí část prvků popsat v obrázku písmeny a zbytek barevně v kombinaci s legendou. Dále je v textu několik překlepů a neobratných slovních spojení. Celkově hodnotím práci jako uspokojivou/D.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků a cílů zadání C
Postup a rozsah řešení, adekvátnost použitých metod D
Vlastní přínos a originalita D
Schopnost interpretovat dosaž. vysledky a vyvozovat z nich závěry C
Využitelnost výsledků v praxi nebo teorii C
Logické uspořádání práce a formální náležitosti C
Grafická, stylistická úprava a pravopis C
Práce s literaturou včetně citací B
Topics for thesis defence:
  1. Popiš výpočet koherenční délky emitovaného fluorescenčního záření.
  2. Popiš metodu STED a způsob filtrování fotonů, které jsou emitovány z dvakrát excitované oblasti vzorku.
  3. Popiš experiment z obrázku 4.6. Detailněji popiš, proč se experiment nepovedl.

Grade proposed by reviewer: D

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová