Master's Thesis

Flow-chambers for microscopy of living cells

Final Thesis 2.63 MB

Author of thesis: Ing. Jana Čolláková

Acad. year: 2010/2011

Supervisor: Ing. Martin Antoš, Ph.D.

Reviewer: Ing. Jan Ježek, Ph.D.

Abstract:

The perfusion chamber for long term observing of live cells by the means the Coherence-Controlled Holographic Microscope (CCHM) was designed. CCHM was built and designed at the Laboratory of the optical microscopy at the Institute of Physical Engineering, Brno University of Technology.
CCHM can quantitatively evaluate dynamical changes inside live cells thanks to the quantitative information about phase shift in each pixel of the image. In order to demonstrate advantages of CCHM experimentally, it is important to keep the live cells in the good conditions. This is made by adding the fresh cultivation medium for studied cells directly in the microscope.
In contrast to the stationary chamber the perfusion chamber allows both the cultivation medium exchange and the application of biological reagents without the necessity of removing the chamber from the microscope. Therefore we can study the vital signs of cells before and after the application of reagents.
An original perfusion system with accessories compatible with CCHM was designed. The design is based on the previously published perfusion system solutions that are referred to in this thesis. The flow characteristics and medium exchange process was discussed and a modification of the internal geometry, based on numerical simulations, was introduced. The applicability of this perfusion chamber has been proven for the CCHM and even for different types of microscopes. The reactions of tumor and epithelial cells during the change of the environment from the cultivation medium to the physiologically solution were studied.

Keywords:

Coherence-controlled holographic microscope, live cell imaging, perfusion chamber.

Date of defence

20.06.2011

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaAznamka

Grading

A

Language of thesis

Czech

Faculty

Department

Study programme

Applied Sciences in Engineering (N3901-2)

Field of study

Precise Mechanics and Optics (M-PMO)

Composition of Committee

prof. RNDr. Tomáš Šikola, CSc. (předseda)
prof. RNDr. Miroslav Liška, DrSc. (místopředseda)
prof. RNDr. Bohumila Lencová, CSc. (člen)
doc. RNDr. Josef Kuběna, CSc. (člen)
prof. RNDr. Jiří Komrska, CSc. (člen)
prof. RNDr. Pavel Zemánek, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Petr Dub, CSc. (člen)
prof. RNDr. Radim Chmelík, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Ivan Křupka, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Jiří Spousta, Ph.D. (člen)
RNDr. Antonín Fejfar, CSc. (člen)

Supervisor’s report
Ing. Martin Antoš, Ph.D.

Předložená práce má 49 stran, obsahuje 1 tabulku a 31 obrázků, z nichž 7 obrázků je převzato.
Cílem bylo navrhnout, vyrobit a ověřit funkčnost průtokových komůrek k pozorování živých buněk s ohledem na parametry digitálního holografického mikroskopu. V úvodních částech práce diplomantka zpracovala podrobný přehled historie vývoje konstrukce průtokových komůrek a zformulovala požadavky ke stavbě vlastní komůrky. Následně provedla simulace proudění kapaliny v programu Ansys Fluent pro navržené tvary vnitřního prostoru komůrky. Skutečná výměna kapalin při gravitačním zaplavování vnitřního prostoru komůrky byla v souladu s provedenými teoretickými simulacemi. Bylo prokázáno, že vyrobené průtokové komůrky umožňují bezproblémovou dlouhodobou kultivaci živých buněk a nepřetržité sledování jejich reakcí před a po výměně média.

Jana Čolláková absolvovala týdenní odborný kurz ve Fakultní nemocnici Královské Vinohrady v Praze, kde si v Laboratoři buněčné biologie a kultivací osvojila základní postupy buněčné kultivace. Při ověřování funkčnosti průtokového systému v transmisním koherencí řízeném holografickém mikroskopu postupovala diplomantka promyšleně a systematicky. K řešení diplomové práce přistupovala zodpovědně a všechny její cíle úspěšně splnila.

Práci doporučuji k obhajobě a hodnotím ji známkou velmi dobře/B.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků a cílů zadání A
Postup a rozsah řešení, adekvátnost použitých metod B
Vlastní přínos a originalita B
Schopnost interpretovat dosažené vysledky a vyvozovat z nich závěry B
Využitelnost výsledků v praxi nebo teorii A
Logické uspořádání práce a formální náležitosti B
Grafická, stylistická úprava a pravopis B
Práce s literaturou včetně citací A
Samostatnost studenta při zpracování tématu A

Grade proposed by supervisor: B

Reviewer’s report
Ing. Jan Ježek, Ph.D.

Předložená práce je formálně rozdělena do pěti kapitol. První kapitola uvádí důvody vzniku pozorovacích komůrek a jejich historický přehled. Dále nastiňuje předpoklady ze kterých se vycházelo při samotném návrhu komůrky popsaném ve druhé kapitole. Ve druhé kapitole je popsán konstrukční návrh komůrky včetně jejího uchycení na stolek mikroskopu. Následující kapitola se zabývá prouděním tekutiny komůrkou a to jak teoretickým rozborem v programu Fluent, tak i reálným měřením. Ve čtvrté kapitole jsou ukázány experimentální výsledky použití navržené komůrky v práci s živými buňkami. V závěru jsou shrnuty dosažené výsledky.
Členění diplomové práce a sled jednotlivých kapitole je logické, práce je vhodně a přehledně zpracována. Po gramatické stránce hodnotím práci jako dobrou. Občas se v delším souvětí ztratí shoda podmětu s přísudkem, např. v první větě kapitoly 1.5.4. Co se týká stylistické stránky práce chtěl bych vytknout vzhled obrázku číslo 14, bylo by přehlednější a vhodnější aby obě části obrázku byly na jedné stránce. Na to jak je jednoduchý je zbytečně velký. V grafu na obrázku číslo 15 je chyba v popisu dat a mělo by zde být uvedeno, že černá čára značí lineární aproximaci. V experimentech s měřením průtoků by bylo vhodné uvést zda změnu průtoku zaškrcováním hadičky lze kalibrovat bez nutnosti jeho měření při každém nastavení. Na základě teoretického popisu je uvedeno, že pro experimenty bude využito převážně jádro 3. Chybí mi experimentální porovnání s jádrem 1, tj. sada obrázků stejná jako obrázek 18, ale s jádrem 3. V kapitole 4.6 je popsán rozdíl v přežívání buněk v komůrce bez promývání roztokem a v komůrce se stálým průtokem. Rychlost průtoku 1 ml.min-1 je při objemu komůrky 0,8 ml pro tyto experimenty příliš vysoká. Buňky mohou být strhávány tokem kapaliny. Bylo by lepší zvolit rychlost výrazně nižší, aby k výměně média nepřispíval pouze tok kapaliny, ale i difúze.
Předloženou práci hodnotím jako zdařilou a vyváženou a doporučuji ji k obhajobě.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků a cílů zadání A
Postup a rozsah řešení, adekvátnost použitých metod B
Vlastní přínos a originalita B
Schopnost interpretovat dosaž. vysledky a vyvozovat z nich závěry B
Využitelnost výsledků v praxi nebo teorii A
Logické uspořádání práce a formální náležitosti A
Grafická, stylistická úprava a pravopis B
Práce s literaturou včetně citací A
Topics for thesis defence:
  1. Zajímalo by mě jakým způsobem se změnila odlévací forma pro jádro 3? Nedochází při rozebírání formy k poškozování silikonu v okolí vtokového a výtokového kanálu? Bylo provedeno dlouhodobé měření přežívání buněk v uzavřené komoře na mikroskopu, tak aby byl zahrnut celý buněčný cyklus? Jak dlouhý je buněčný cyklus pro použité typy buněk?

Grade proposed by reviewer: B

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová