Master's Thesis

Evaluation of ground cinnamon authenticity using qPCR-HRM

Final Thesis 3.84 MB

Author of thesis: Bc. et Bc. Jiří Zikmund

Acad. year: 2025/2026

Supervisor: Ing. Lenka Fialová, Ph.D.

Reviewer: Ing. Štěpánka Trachtová, Ph.D.

Abstract:

This diploma thesis focuses on monitoring the authenticity of commercial ground cinnamon samples using molecular-biological and analytical methods. The aim of the study was to identify the botanical species of cinnamon present in commercial ground cinnamon samples using real-time PCR combined with high-resolution melting (HRM) curve analysis, utilizing TPS 1, TPS 3, ITS 2, and psbA-trnH primers.
DNA was extracted using two different procedures: a commercial EliGene kit and the CTAB protocol. It was found that DNA extraction using the commercial kit yielded viable isolates only for leaf samples. To successfully extract DNA from the commercial ground cinnamon samples, the application of the CTAB protocol was essential. Subsequent DNA amplification of the commercial samples was successfully performed using the TPS 1, ITS 2, and psbA-trnH primers. The TPS 1 primers provided the most reliable results, whereas the TPS 3 primers were evaluated as unsuitable for this specific analysis.
To verify and compare the results obtained via PCR, the coumarin content in the tested ground cinnamon samples was determined using high-performance liquid chromatography (HPLC). Based on the detected coumarin levels, the samples were classified according to the probable proportions of Ceylon cinnamon and Cassia.
The thesis highlights the effectiveness of combining real-time PCR with HRM and the analytical determination of coumarin content (HPLC) to verify the authenticity, quality, and health safety of commercially available ground cinnamon.

Keywords:

cinnamon, coumarin, real-time PCR, HRM analysis, HPLC

Date of defence

01.06.2026

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaBznamka

Grading

B

Process of defence

1. Student seznámil členy komise s náplní a cílem diplomové práce. 2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci. 3. Student akceptoval všechny připomínky oponentky a na všechny otázky odpověděl v plné šíři. Diskuse: prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. Je kumarin toxický? Souvisí toxicita kumarinu se srážlivostí krve? doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. V rámci obhajoby jste zmínil fluorovaný fenol, můžete to prosím objasnit? Jak je tento problém zakotven v legislativě? Musí výrobce uvádět botanický původ skořice? Stanovovali jste v práci míru nejistoty? Víte, jaká by byla míra nejistoty Vámi použitých metod? Jaké jsou další způsoby falšování skořice? Jakými metodami je to možné odhalit? Existují limity kumarinu ve stravě, např. doporučení denní limity? Jaké jsou hodnoty? prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. Byla u použitých vzorků uvedena země původu? Zkoušel jste skořice i senzoricky? Je mezi nimi znát rozdíl? Třeba co se týká vůně či chuti? Student odpověděl na všechny doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. Diplomant prokázal velmi dobré odborné znalosti i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.

Language of thesis

Czech

Faculty

Department

Study programme

Chemistry of Natural Products (NKCP_CHPL)

Composition of Committee

prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
prof. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D. (místopředseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Iva Burešová, Ph.D. (člen)

Supervisor’s report
Ing. Lenka Fialová, Ph.D.

Hlavními cíli diplomové práce Jiřího Zikmunda bylo testování využitelnosti primerů navržených v rámci jiné diplomové práce pro analýzu mleté skořice, a porovnání získaných výsledků s jinými metodami, které se k tomuto účelu využívají. Míra podobnosti práce s jinými dokumenty je 2,4 % , lze ji proto považovat za originální a původní. Teoretická část práce je zpracována kvalitně, po jazykové stránce bez chyb a je podložena dostatečným množstvím aktuální odborné literatury. Student taktéž projevil samostatnost při shánění referenčních vzorků, při provádění experimentů a při zpracování výsledků, které zahrnovalo i použití pokročilého softwaru. Výsledky provedených experimentů byly průběžně konzultovány, ale během psaní výsledkové části práce mohly být konzultace využívány častěji.  Méně časté využívání konzultací se projevilo zejména na diskusi, která mohla být obsáhlejší, a na přehlednosti některých grafů. Přes výše uvedené nedostatky předloženou práci doporučuji k obhajobě a hodnotím známkou B - velmi dobře.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Studium literatury a její zpracování A
Využití poznatků z literatury B
Kvalita zpracování výsledků B
Interpretace výsledků, jejich diskuse B
Závěry práce a jejich formulace B
Využívání konzultací při řešení práce B
Celkový přístup k řešení úkolů A

Grade proposed by supervisor: B

Diplomová práce je zaměřena na analýzu autenticity komerčních vzorků mleté skořice pomocí molekulárně biologické metody qPCR HRM a její porovnání s analytickým stanovením kumarinu metodou HPLC. Zadání zahrnovalo izolaci DNA, optimalizaci PCR analýzy, vyhodnocení výsledků a jejich srovnání s alternativní metodou.
Teoretická část práce je systematicky strukturovaná a poskytuje ucelený přehled o problematice autenticity skořice, metodách jejího ověřování i principech molekulární biologie a chromatografie. Velmi pozitivně hodnotím propojení genetických metod s chemickou analýzou a srozumitelné vysvětlení významu kumarinu jako markeru autenticity a bezpečnosti potravin. Text je přehledný, logicky členěný a vhodně doplněný tabulkami a obrázky. Použitá literatura je aktuální a relevantní.
V rámci experimentální části byly porovnány dvě metody izolace DNA – komerční kit EliGene a CTAB protokol – přičemž výsledky jasně ukazují zásadní vliv typu matrice na jejich účinnost. V této souvislosti však postrádám hlubší komentář; zejména není zcela zřejmé, zda student při interpretaci výsledků zohlednil rozdílnou navážku vzorků použitou při jednotlivých metodách. Dále byla provedena optimalizace PCR podmínek a testování několika primerů.
Určitou slabinou práce je absence podrobnější statistické analýzy výsledků a omezený počet opakování, což může ovlivnit robustnost závěrů. Stejně tak lze identifikovat určité nedostatky v rámci stanovení kumarinu metodou HPLC, kde by byla vhodná důkladnější optimalizace metody a ověření identity dalších detekovaných látek. Výsledky jsou prezentovány pomocí grafů, tabulek i dendrogramů. Student interpretuje HRM křivky i chromatografická data a snaží se identifikovat příčiny nesouladu mezi použitými metodami.
V rámci diskuse student reflektuje limity jednotlivých primerů, přičemž jako nejvhodnější se ukázaly primery TPS1, zatímco primery TPS3 a ITS2 vykazovaly horší výsledky. Pozitivně hodnotím také srovnání metod qPCR-HRM a HPLC, které poukazuje na rozdíly mezi genetickou a chemickou identifikací. V některých částech je však diskuse spíše popisná a místy postrádá hlubší kritické zhodnocení získaných výsledků.
Shrnutí výsledků je zpracováno přehledně a umožňuje jasné porovnání jednotlivých použitých metod. Oceňuji snahu o jejich vzájemné propojení a společnou interpretaci, která odhaluje jak shody, tak i nesrovnalosti mezi výsledky molekulární analýzy a stanovení kumarinu metodou HPLC.
Po formální stránce je práce dobré úrovni. Text je srozumitelný, odborně formulovaný a logicky strukturovaný. Obrázky a grafy jsou kvalitně zpracovány a vhodně doplňují text. Objevují se pouze drobné stylistické a formální nepřesnosti.
Práce přináší využitelné poznatky v oblasti ověřování autenticity potravin, výsledky ukazují, že kombinace molekulárních metod a stanovení kumarinu představuje vhodný přístup ke kontrole kvality potravin. Kontrola podobnosti v systému Thesis vykazuje hodnotu 2,4 %, což svědčí o velmi vysoké míře originality práce a původnosti prezentovaných výsledků.
Diplomová práce je tematicky aktuální a splňuje všechny požadavky kladené na závěrečné práce navazujícího magisterského studia. Práci doporučuji k obhajobě s návrhem klasifikace stupněm B.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Logické členění práce A
Kvalita zpracování výsledků C
Interpretace výsledků, jejich diskuse C
Využití literatury a její citace A
Úroveň jazykového zpracování A
Formální úroveň práce – celkový dojem B
Závěry práce a jejich formulace C
Topics for thesis defence:
  1. 1. Jak si vysvětlujete nesoulad mezi výsledky qPCR-HRM a HPLC u některých vzorků (např. vzorek č. 4 nebo č. 6)? Kterou z těchto metod byste v takových případech považoval za věrohodnější a proč?
  2. 2. V práci hodnotíte jako nejvhodnější primery TPS1. Jaké vlastnosti těchto primerů pravděpodobně vedou k jejich vyšší účinnosti a jak byste experimentálně ověřil příčiny falešně pozitivních výsledků?
  3. 3. Jak si vysvětlujete rozdíly v koncentraci a čistotě izolované DNA získané pomocí komerčního kitu a CTAB protokolu? Jaký dopad mohou mít tyto rozdíly na výsledky qPCR-HRM analýzy?

Grade proposed by reviewer: B

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová