Master's Thesis

Characteristics of active substances produced by probiotic microorganisms

Author of thesis: Bc. Jan Cveček

Acad. year: 2025/2026

Supervisor: prof. RNDr. Ivana Márová, CSc.

Reviewer: Ing. Julie Hoová, Ph.D.

Abstract:

Subject of this master thesis was to investigate probiotic clinical isolates acquired from industrial partner and characterize selected isolates. Probiotics are living microorganisms, mostly bacteria, which, applied in appropriate dose, are beneficial for human health. Adherence to intestinal epithelium, biofilm formation, production of antimicrobial and immuno-stimulating compounds, which help to inhibit growth of pathogenic bacteria and yeast in human intestine, belong to the essential properties of probiotics. Apart from lactic acid and acetic acid, which exhibit antimicrobial activity, probiotics can produce antimicrobial peptides called bacteriocins. These peptides exhibit their own antimicrobial activity by formation of pores in cytoplasmatic membrane of sensitive bacteria. Therefore, bacteriocins could be potentially used as food preservatives and alternatives to antibiotics in healthcare industry. Nowadays, nisin is the only bacteriocin that is used as food preservative.
In experimental part of this thesis, the properties of probiotic isolates such as biofilm formation, production of organic acids and antimicrobial activity were studied. The formation of biofilm was studied by Christensen method, which proved that 14 out of 20 isolates belong to strong biofilm producers. Antimicrobial activity was tested against three indicator microorganisms. The highest antimicrobial activity was detected against Escherichia coli, then slightly lower activity was detected against Staphylococcus epidermidis, and no activity was detected against yeast Candida glabrata. In the second part of thesis, antimicrobial activity of selected probiotic isolates was compared to antimicrobial activity of lactic acid and bacteriocin nisin. The aim of comparison was to prove the presence of antimicrobial compounds other than organic acids. Antimicrobial activity of probiotic isolates (500 mg/ml) were slightly higher than of lactic acid of the same concentration, which indirectly proves the presence of other antimicrobial compounds. In the final part of this thesis, selected probiotic isolates were examined for presence of genes encoding bacteriocins called plantaricins by real time polymerase chain reaction. The results of this thesis proved presence of bacteriocins in probiotics clinical isolate SS2 by indirect detection methods.

Keywords:

Probiotics, bacteriocins, lactic acid, acetic acid, antimicrobial activity, plantaricins, polymerase chain reaction

Date of defence

25.05.2026

Date of publish

24.05.2028

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaAznamka

Grading

A

Process of defence

1. Student seznámil členy komise s náplní a cílem diplomové práce. 2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci. 3. Student akceptoval všechny připomínky oponentky a na všechny otázky odpověděl v plné šíři. Diskuse: doc. Ing. Petr Sedláček, Ph.D. V jaké růstové fázi dochází k největší produkci antimikrobiálních látek? Jak se liší v množství v různých fází růstové křivky? prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. Čím si vysvětlujete nejvyšší antimikrobiální účinky testů proti bakterii E. coli? Mgr. Ondřej Vašíček, Ph.D. Stanovovali jste optickou densitu buněk na konci kultivace? Zmínil jste pojmy prebiotikum a postbiotikum, můžete je objasnit? Jaké jsou v nich rozdíly? Jakou roli v tom hraje třeba kyselina octová a další Vámi stanovované látky? Student odpověděl na všechny doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. V diskusi student prokázal výbornou orientaci v dané problematice. Po diskusi následovalo hodnocení závěrečné práce. Diplomant prokázal nejen výborné odborné znalosti, ale i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.

Language of thesis

Czech

Faculty

Fakulta chemická

Department

Institute of Food Science and Biotechnology

Study programme

Chemistry for Medical Application (NPCP_CHMA)

Specialization

Chemistry of Bioactive Substances (CHBL)

Composition of Committee

prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
doc. Ing. Petr Sedláček, Ph.D. (místopředseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
Mgr. Ondřej Vašíček, Ph.D. (člen)

Supervisor’s report
prof. RNDr. Ivana Márová, CSc.

Cílem práce řešené v kooperaci s průmyslovým partnerem bylo nalézt sestavu parametrů pro charakterizaci probiotického účinku bakterií (klinických izolátů i sbírkových kmenů)  získaných od firmy Fermatigo, s.r.o.

Student přistupoval k práci s velkým zájmem, tvůrčím přístupem a ochotou věnovat práci nadstandardní množstí času. V rámci práce zvládl kultivační techniky a optimalizoval a otestoval několik nových nebo upravených metod pro popis probiotického účinku, jako je schopnost tvořit biofilm, produkce organických kyselin, antimikrobiální aktivita. Současně se zaměřil na průkaz produkce bakteriocinů u klinických vzorků a jejich srovnání se standardními preparáty. K identifikaci produkce biocinů byly použity elektromirační metody a qPCR; speciální pozornost byla věnována produkci plantaricinů.

Spektrum zahrnutých metod je úctyhodné, po zaučení student pracoval samostatně, s potřebnou laboratorní zručností a metody aktivně rozvíjel. Získané výsledky komplexně  interpetoval a posoudil v kontextu literárních údajů.
Výsledkem je zdařilá diplomová práce, jejíž dílčí výsledky byly již prezentovány na mezinárodní konferenci a budou využity průmyslovým partnerem.

Celkově hodnotím práci Bc. Jana Cvečka velmi pozitivně, aktivně využíval konzultace a spolupráci v týmu. Sepsal kvalitní diplomovou práci, která byla kladně přijata odbornou komunitou i průmyslovým partnerem.

Z výše uvedených důvodů práci doporučuji k obhajobě a hodnotím stupněm A (výborně).
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Studium literatury a její zpracování A
Využití poznatků z literatury A
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Závěry práce a jejich formulace A
Využívání konzultací při řešení práce A
Celkový přístup k řešení úkolů A

Grade proposed by supervisor: A

Reviewer’s report
Ing. Julie Hoová, Ph.D.

Diplomová práce Bc. Jana Cvečka je zaměřena na studium biologických vlastností získaných oribiotických klinických izolátů od firmy Fermigo s.r.o. s následnou nepřímou detekcí vybraných bakteriocinů pomocí qPCR.
V teoretické části student velmi detailně popisuje probiotické bakterie a dělení bakteriocinů jimi produkovanými, dále také techniky měření pro jejich charakterizaci a identifikaci. Teoretická část je velmi obsáhlá a pokrývá celou experimentální část.
V experimentální části se student nejprve zabýval potvrzením vlastností probiotik, a to tvorbou biofilmu a stanovením množství produkovaných kyselin. Důležitou součástí bylo také sledování antimikrobiální aktivity, kdy bylo zjištěno, že některé vzorky izolátu mohou být potenciálními producenty bakteriocinu. V této práci bylo vybráno sledování bakteriocinu plantaricin. Tento bakteriocin byl potvrzen nepřímou metodou qPCR. Zde musím vyzdvihnout diskuzi studenta s literaturou na vysoké úrovni. Pro dokreslení celého obrazu práce, student bohužel nejspíše neznal přesné složení izolátů, aby výsledky mohl diskutovat konkrétně, i tak se mu povedlo naměřené výsledky okomentovat.
V práci se vyskytuje pár menších nesrovnalostí, které by bylo vhodné do budoucna opravit. Např. kontaminovaná negativní kontrola u měření pomocí qPCR (obrázek 26). Dále také to, že dle obrázku mikrotitrační destičky (obrázek 22) nebylo zahrnuto nejoptimálnější pH rozmezí pro reakci s resazurinem, respektive, zda výběr této metody byl správný. Také bych navrhla případně stanovení antimikrobiální aktivity také u nižších koncentrací vzorků, jelikož velmi často nedocházelo mezi vzorky k velkým rozdílům, a tak stanovená MIC může být reálně nižší.
Tyto mé poznatky nesnižují hodnotu diplomové práce studenta Bc. Jana Cvečka, a proto jej doporučuji k obhajobě a hodnotím známkou „A“.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání B
Logické členění práce A
Kvalita zpracování výsledků B
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Využití literatury a její citace A
Úroveň jazykového zpracování A
Formální úroveň práce – celkový dojem A
Závěry práce a jejich formulace A
Topics for thesis defence:
  1. Kdy byla ukončena kultivace, pro stanovení vybraných kyselin? Jednalo se o stacionární fázi?
  2. Proč byla zvolena nižsí maximální koncentrace nisinu oproti testovanému lyofilizátu a nebyla stanovena také MIC? Co z výsledků stanovení antimikrobiální aktivity nisinu tedy plyne?
  3. V jakém pH rozmezí je resazurin nejspolehlivějším redoxním indikátorem?
  4. V kapitole 6.4.3 tvrdíte, že se vyskytla jiná varianta plantaricinu A? O jakou by se mohlo jednat?

Grade proposed by reviewer: A

Reasons for publication postponement

Publication of the final thesis has been postponed in compliance with the provisions of Section 47b (4) of Act No. 111/1998 Coll., on the Higher Education Institutions and on amendments and supplements to other acts, as amended.

The work is carried out in collaboration with the industrial partner Fermatigo, s.r.o., with the aim of its anticipated commercial application. The work forms a partial component of experiments conducted within the industrial PhD programme of Ing. Vojáčková, for which a formal intellectual property protection agreement has been concluded, governing cooperation with the Master's students involved.

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová