Master's Thesis

The effect of natural substances on UV-induced senescence

Final Thesis 3.56 MB

Author of thesis: Bc. Tereza Druláková

Acad. year: 2025/2026

Supervisor: prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D.

Reviewer: Ing. Lenka Fialová, Ph.D.

Abstract:

This master’s thesis investigated the effect of natural compounds with antioxidant properties epigallocatechin gallate (EGCG) and grapefruit seed extract (GSE) on the cell viability of human dermal fibroblasts (HDF) and human epidermal keratinocytes (HaCaT). The study also examined the effect of these compounds on UVA and UVC-induced cellular senescence. Natural compound concentrations for subsequent experiments were determined using the MTT viability assay, specifically 100 µmol/L for EGCG and 2.5 mg/mL for GSE. Cellular senescence induction by UVA and UVC irradiation was optimized using the SA-β-gal assay to determine optimal irradiation doses. Changes in senescence marker expression were evaluated by RT-qPCR. The results showed that EGCG presence in UVA-induced senescent HaCaT cells led to reduced p21 expression and undetectable p16 expression compared to cells without EGCG. No protective effect of EGCG was observed in HDF cells under the same experimental conditions. In the case of UVC-induced senescence, GSE presence was associated with reduced cytotoxic effects of irradiation, with a more pronounced effect observed in HDF cells compared to HaCaT cells. Based on the obtained results, the thesis contributes to a better understanding of the effects of natural antioxidant compounds on UV-induced cellular senescence, which is dependent on the cell model, stress level, and additional experimental conditions. Therefore, natural antioxidant compounds cannot be considered universally protective under all circumstances.

Keywords:

Cellular senescence, natural substances, fibroblasts (HDF), keratinocytes (HaCaT), epigallocatechin gallate (EGCG), grapefruit seed extract (GSE), RT-qPCR

Date of defence

28.05.2026

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaAznamka

Grading

A

Process of defence

1. Studentka seznámila členy komise s náplní a cílem diplomové práce. 2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci. 3. Studentka akceptovala všechny připomínky oponentky a na všechny otázky odpověděla v plné šíři. Diskuse: prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. U některých onemocnění se nedoporučuje užívání grepu, narazila jste na toto doporučení během studia literatury? Víte, s jakými léky interagují látky grepu? Myslíte, že to může mít souvislost i s Vašimi výsledky? Jsou antioxidační účinky grepu potvrzeny? Dochází i ke korekci poškozených struktur? Jaká byla použita vlnová délka při expozici? Proč je u senescentních buněk vysoká hladina galaktosidásy? Můžete objasnit účinek galátů na fibroblasty? doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. Zmiňujete senescenci buňky, můžete to prosím vysvětlit? Jaké jsou aplikační výsledky Vaší práce? Studentka odpověděla na všechny doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. V diskusi studentka prokázala výbornou orientaci v dané problematice. Po diskusi následovalo hodnocení závěrečné práce. Diplomantka prokázala nejen výborné odborné znalosti, ale i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.

Language of thesis

Czech

Faculty

Department

Study programme

Chemistry of Natural Products (NPCP_CHPL)

Composition of Committee

prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
prof. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D. (místopředseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Iva Burešová, Ph.D. (člen)
prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D. (člen)

Supervisor’s report
prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D.

Diplomová práce Terezy Drulákové vykazuje velmi nízkou míru shody s jinými dokumenty (pod 1 %), což svědčí o vysoké míře originality zpracování. Práce je zaměřena na studium vlivu přírodních látek na UV indukovanou buněčnou senescenci a kombinuje kvalitně zpracovanou teoretickou část s experimentální částí realizovanou na buněčných modelech fibroblastů a keratinocytů. Studentka úspěšně zvládla metodiky zahrnující kultivaci buněk, test viability MTT, SA β gal test i RT qPCR a prokázala schopnost samostatné práce a kritické interpretace výsledků. Bylo prokázáno, že účinky sledovaných látek (EGCG a GSE) na senescenci jsou závislé na typu buněk i podmínkách experimentu a nelze je považovat za univerzálně protektivní. Výsledky jsou přehledně prezentovány a diskutovány v kontextu současných poznatků a práce má potenciál dalšího využití v oblasti výzkumu buněčného stárnutí a ochranných mechanismů. Práce splňuje všechny požadavky kladené na diplomovou práci, doporučuji ji k obhajobě a navrhuji hodnocení výborně (A).
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Studium literatury a její zpracování A
Využití poznatků z literatury A
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Závěry práce a jejich formulace A
Využívání konzultací při řešení práce A
Celkový přístup k řešení úkolů A

Grade proposed by supervisor: A

Reviewer’s report
Ing. Lenka Fialová, Ph.D.

Hlavními cíli diplomové práce Terezy Drulákové bylo studium vlivu epigallokatechin-gallátu (EGCG) a extraktu z grepových jader (GSE) na viabilitu dvou typů lidských kožních buněk, a také sledování vlivu zmíněných látek na UV-zářením vyvolanou senescenci těchto buněk. Téma je vysoce aktuální a teoretická část práce je napsána přehledně a srozumitelně, s občasným výskytem překlepů, které ale odbornou úroveň textu výrazně nesnižují. Celá práce je podložena sedmdesáti čtyřmi literárními zdroji, z nichž většinu tvoří zahraniční články v odborných časopisech. Výsledková část práce je napsána čtivě a závěry až na jednu výjimku odpovídají uvedeným výsledkům. Touto výjimkou je závěr na str. 55, kde autorka uvádí, že metoda RT-PCR nebyla vhodná pro analýzu vzorků s přidaným extraktem z grepových jader. V tomto případě byla spíše než PCR hlavním problémem použitá metoda izolace RNA. K výsledkové části mám několik dalších výhrad:
•    V části kapitoly 4.2, která se zabývá stanovením vhodné dávky UVA záření pro vyvolání buněčné senescence, autorka uvádí tři fotografie lidských fibroblastů po ozáření třemi různými dávkami UVA záření, ale v případě lidských keratinocytů je uvedena pouze jedna fotografie. V tomto případě by bylo vhodné uvést výsledky experimentů s keratinocyty v podobném rozsahu, jako je tomu u výsledků experimentů s fibroblasty.
•    Bylo by vhodné uvést alespoň do přílohy výsledky izolace RNA.
•    Na snímky buněk by bylo vhodné uvést měřítko (alespoň v případech, kdy snímek slouží jako podklad diskuse o velikosti buněk).
•    V textu chybí odkazy na některé snímky a grafy (např. obr. 17 a 18, graf 6, který není diskutován vůbec).
•    Obrázky 23 a 24 jsou vloženy v nízké kvalitě a chybí v nich legenda, obr. 24 je popsán jako závislost integrované intenzity fluorescence na teplotě, přestože se jedná o fluorescenci derivovanou.
•    Přehlednost tabulek č. 9 a 10 by byla lepší bez svislého ohraničení. Dále by přehlednost tabulek zlepšilo uspořádání výsledků dle dávky UV záření, kdy by ihned po každém kontrolním vzorku následovaly vzorky s přidaným EGCG (respektive GSE) a oddělení jednotlivých skupin vzorků pomocí silnějšího ohraničení.
I přes výše zmíněné nedostatky byly cíle práce splněny v plné šíři. Práci doporučuji k obhajobě a hodnotím známkou A – výborně.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Logické členění práce A
Kvalita zpracování výsledků B
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Využití literatury a její citace A
Úroveň jazykového zpracování A
Formální úroveň práce – celkový dojem B
Závěry práce a jejich formulace A
Topics for thesis defence:
  1. Na str. 55 zmiňujete vznik bezbarvých viskózních shluků v roztoku během izolace RNA ze vzorků s GSE. O jaký typ kontaminantů se vzhledem ke složení vzorků mohlo jednat?
  2. Existuje postup izolace RNA, jehož pomocí by bylo možné odstranit kontaminanty pocházející z GSE a zároveň zachovat integritu RNA? Pokud ano, popište takový postup.
  3. V práci jste využívala GSE o koncentraci 2,5 mg/ml a EGCG o koncentraci 100 μmol/l. Dovoluje současná evropská legislativa využití GSE a EGCG o těchto koncentracích v kosmetických výrobcích?

Grade proposed by reviewer: A

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová