Master's Thesis

Bioinformatic analysis of short RNA molecule representation in transgenic Nicotiana tabacum during its cultivation

Final Thesis 8.11 MB

Author of thesis: Bc. Dominika Hanušová

Acad. year: 2025/2026

Supervisor: Mgr. Ing. Kateřina Řehůřková, Ph.D.

Reviewer: doc. RNDr. Miloslava Fojtová, Ph.D.

Abstract:

Somatic embryogenesis is a unique process of regenerating plant tissue into a new organism. Although it is a widely studied phenomenon, the complete mechanism is still unknown. The complexity of processes leading to reprogramming somatic cells into embryonic ones requires precise regulatory mechanisms. One of the regulators beside phytohormones is small RNAs (sRNAs). In this study we provide an sRNA profile analysis throughout the whole process of somatic embryogenesis of the transgenic plant Nicotiana tabacum HoLo1. Besides the dedifferentiation and regeneration, the aging of the callus culture was studied. The selected isolates of RNA were identified by sequencing and using bioinformatic tools. The dataset was quantified and annotated by miRDeep2 after the initial quality check and trimming. Differential expression analysis using DESeq2 showed some interesting miRNAs potentially playing a role in somatic embryogenesis. Their function was determined by comparing sequences against cDNA from N. tabacum using psRNATargeter and by comparison with the literature. Some molecules involved in regulation of phytohormonal pathways were identified. For example, miR156, miR172 and miR394, play a critical role in WUSCHEL protein regulation. Other molecules such as miR398, miR408 or miR397 could help with the transition from adult tissue to the callus state by inhibiting photosynthetic protein expression. It was also observed that the aging of the callus culture has a significant impact on the sRNA profile, which can relate to cell adaptation and changing the regulatory mechanisms. Based on the results, it was confirmed that the small RNAs are important regulators in the dedifferentiation and regeneration of plant cells.

Keywords:

Somatic embryogenesis. Nicotiana tabacum, small RNA, miRNA, dedifferentiation

Date of defence

25.05.2026

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaAznamka

Grading

A

Process of defence

1. Studentka seznámila členy komise s náplní a cílem diplomové práce. 2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci. 3. Studentka akceptovala všechny připomínky oponentky a na všechny otázky odpověděla v plné šíři. Diskuse: prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. Z jakého důvodu byl použit přímo transgenní kmen tabáku? Je možné rostlinné kultury mrazit? V jaké formě se tedy rostlinné kultury uchovávají po delší dobu? Jaká strategie je dobrá pro množení rostlinných buněk? Je to možné použít na kalus? Můžete do toho nějak zasáhnout pomocí aktivátorů? doc. Ing. Petr Sedláček, Ph.D. Zmínila jste že, stárnutí kalusu může ovlivnit aplikační možnosti, můžete to objasnit? Jaké to může mít aplikační možnosti nebo se to zaměřuje jen na výzkum? Je dobré k dlouhodobému uchovávání volit právě pasažování kalusu? Zmínila jste, že první krok trvá 12 týdnů, a pak další měsíce jste sledovala, vše jste stihla v rámci diplomové práce? Mgr. Ondřej Vašíček, Ph.D. Je výhodné na základě profilu microRNA kalusy nechat stárnout? Studentka odpověděla na všechny doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. V diskusi studentka prokázala výbornou orientaci v dané problematice. Po diskusi následovalo hodnocení závěrečné práce. Diplomantka prokázala nejen výborné odborné znalosti, ale i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.

Language of thesis

Czech

Faculty

Fakulta chemická

Department

Institute of Food Science and Biotechnology

Study programme

Chemistry for Medical Application (NPCP_CHMA)

Specialization

Chemistry of Bioactive Substances (CHBL)

Composition of Committee

prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
doc. Ing. Petr Sedláček, Ph.D. (místopředseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
Mgr. Ondřej Vašíček, Ph.D. (člen)

Supervisor’s report
Mgr. Ing. Kateřina Řehůřková, Ph.D.

Bc. Dominika Hanušová na své DP pracovala s ohromným nasazením, což se promítlo také do velmi dobré kvality vzniklé práce. Projevila velkou míru samostatnosti ve studiu literatury a možných metodických přístupů. Také prokázala schopnosti uvážlivě a pečlivě analyzovat získaná bioinformatická data. To vše jí předurčuje k následující kvalitní vědecké kariéře. Její výsledky popsané v DP budou tento rok publikovány ve vědeckém periodiku jako součást připravovaného článku.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Studium literatury a její zpracování A
Využití poznatků z literatury A
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Závěry práce a jejich formulace A
Využívání konzultací při řešení práce A
Celkový přístup k řešení úkolů A

Grade proposed by supervisor: A

Reviewer’s report
doc. RNDr. Miloslava Fojtová, Ph.D.

Dominika Hanušová zpracovala ve své diplomové práci zajímavé a vědecky aktuální téma zaměřené na studium hladin miRNA během dlouhodobé kultivace kalusů založených z listů transgenní rostliny Nicotiana tabacum HoLo1. Kalusy a obecně rostlinné tkáňové kultury, jak je ostatně uvedeno v samotné práci, jsou důležité v moderních biotechnologických programech. Pochopení molekulárních procesů probíhajících během dlouhodobé kultivace kalusů založených z různých rostlin a různých rostlinných orgánů, možnosti regenerace rostlin z kalusů různého stáří a variabilita mezi regeneranty jsou pro práci s těmi kulturami velmi důležité. Stejně tak se v poslední době intenzivně řeší regulační úloha nekódujících molekul RNA, včetně krátkých RNA.
Práce je čtivě napsána, s minimem překlepů a stylistických chyb. Doporučila bych pouze konzistentní pravopis týkající se používání „t“ vs. „th“ („metylace“ vs. „ethanol“, „methan“). Struktura je vyvážená, úvod i metodická část jsou dostatečně podrobné, v části Výsledky a diskuse jsou získaná data popsána podrobně a přehledně a velmi dobře diskutovaná.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Logické členění práce A
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Využití literatury a její citace B
Úroveň jazykového zpracování A
Formální úroveň práce – celkový dojem A
Závěry práce a jejich formulace A
Topics for thesis defence:
  1. 1/ Na str. 7 uvádíte, že výskyt 5-metylcytosinu byl potvrzen ve všech organismech. Je tomu skutečně tak? Byl metylovaný cytosin detekován např. v kvasinkách a háďátku?
  2. 2/ Na str. 8 je uvedeno, že po acetylaci dojde k neutralizaci kladného náboje histonů a rozvolnění struktury chromatinu. Většina histonových modifikací je lokalizována blízko N-konce a není v přímém kontaktu s DNA. Jak tedy acetylace histonů strukturu chromatinu ovlivňuje?
  3. 3/ Na str. 11 uvádíte, že aktivitou PolIV vzniká jednovláknová RNA, ke které je syntetizováno druhé vlákno pomocí PolII. Nejde spíše o RdRP, se kterou tvoří PolIV komplex? Je to tak uvedeno i v práci, kterou na tom místě citujete - citace 36: „siRNA biogenesis begins with transcription by PolIV, a plant-specific RNA polymerase, followed by second RNA strand synthesis by RDR2.“
  4. 4/ Má tabák (Nicotiana tabacum) v češtině druhové jméno?
  5. 5/ Jaká je struktura transgenního lokusu HoLo1 a je reportérový gen nptII transribován?
  6. 6/ Zvažovali jste před izolací RNA pomocí kitu nabohatit frakci krátkých RNA pomocí precipitace PEGem?
  7. 7/ Co se týče RNeasy Plant Mini kitu, ten podle manuálu výrobce není optimalizován pro izolaci krátkých molekul RNA (RNeasy Mini Handbook, str. 9).
  8. 8/ Na gelech máte jednu z rRNA označenou jako 28S rRNA. V rostlinných genomech je 25S rRNA. Jedná se o strukturní homolog živočišné 28S rRNA. Molekula u rostlin (a také u kvasinek) je o něco kratší, proto má také nižší sedimentační koeficient (někdy se v literatuře uvádí i 26S).
  9. 9/ Analyzovala jste pouze materiál z transgenní rostliny/kalusu? Porovnávala jste transkripční profily se vzorky rostliny standardního typu?
  10. 10/ V závěru zmiňujete experimenty, které by vedly k ověření vámi navrhovaných hypotéz. Mohla byste navrhnout takový experiment?

Grade proposed by reviewer: A

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová