Master's Thesis

Extraction and analysis of biologically active compounds produced by yeast Metschnikowia pulcherrima

Author of thesis: Bc. Karolína Knopfová

Acad. year: 2025/2026

Supervisor: Ing. Jiří Holub, Ph.D.

Reviewer: Ing. Simona Dzurendová, PhD

Abstract:

This diploma thesis deals with the production and characterization of bioactive metabolites of the yeast Metschnikowia pulcherrima. The theoretical part summarizes current knowledge on the taxonomy, cytology, and production capabilities of this species, with a focus on the pigment pulcherrimin and exopolysaccharides (EPS). The aim of the practical part was to optimize the methods for pigment isolation from cell biomass and the extracellular space, perform a comparative analysis of methods for iron determination, and test the prebiotic potential of the obtained EPS.
As part of the experiments, an optimized extraction protocol was developed, revealing that pretreatment of the biomass with 89.8% methanol is essential for obtaining a pure isolate with a high yield of pulcherrimin. Analytical comparison of the methods demonstrated that complete microwave mineralization followed by ICP-OES measurement is required for accurate quantification of iron in the stable pulcherrimin complex. Conventional colorimetry showed up to a fifty-fold underestimation of the results due to insufficient sample decomposition. The highest specific iron content achieved in the isolate was 12.30 mg/g, confirming the successful concentration of the pigment compared to the initial biomass (0.49 mg/g).
The study of biological properties demonstrated a strong, yet strain-specific prebiotic effect of the isolated EPS. Viability results confirmed that the addition of EPS significantly supports the growth of probiotic bacteria, with the highest stimulation (an increase of up to 1368%) recorded for the strain Lactobacillus casei, while Lactobacillus plantarum also showed excellent results. Furthermore, the thesis provides data on the fatty acid profile, which was dominated by monounsaturated fatty acids (MUFAs), particularly oleic acid, across all cultivations. Quantification of ergosterol and ubiquinone revealed significant differences in their specific production depending on the chosen cultivation scale (flask vs. fermenter). The findings contribute to a better understanding of metabolic processes and expand the possibilities for utilizing M. pulcherrima yeast in industrial applications.

Keywords:

Metschnikowia pulcherrima, non conventional yeasts, bioactive compounds, pulcherrimin, pulcherrimin extraction, probiotics, prebiotics

Date of defence

26.05.2026

Date of publish

25.05.2029

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaAznamka

Grading

A

Process of defence

1. Studentka seznámila členy komise s náplní a cílem diplomové práce. 2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci. 3. Studentka akceptovala všechny připomínky oponentky a na všechny otázky odpověděla v plné šíři. Diskuse: prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. Zmínila jste, že jste kulturu kultivovala v bioreaktoru, jaký objem měl daný bioreaktor? Jaké jsou další typy probiotických kultur? Jaký je aplikační potenciál aktivních látek, které byly v práci produkovány? doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. Zmiňovala jste čistotu daného preparátu, jaké jsou možnosti přečištění? Jaký by byl postup přečištění Vašeho produktu? Jaká je struktura pulcherriminu? prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. Jakým způsobem jste izolovala aktivní látky? Docházelo k vysrážení pulcherriminu? Na základě jakých parametrů byl zvolen aceton? doc. Mgr. Pavel Dvořák, Ph.D. V jaké fázi růstu dochází k produkci pulcherriminu? Jedná se o primární nebo sekundární metabolit? Studentka odpověděla na všechny doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. V diskusi studentka prokázala výbornou orientaci v dané problematice. Po diskusi následovalo hodnocení závěrečné práce. Diplomantka prokázala nejen výborné odborné znalosti, ale i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.

Language of thesis

Czech

Faculty

Fakulta chemická

Department

Institute of Food Science and Biotechnology

Study programme

Chemistry for Medical Application (NPCP_CHMA)

Specialization

Chemistry of Bioactive Substances (CHBL)

Composition of Committee

prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
doc. Ing. Petr Sedláček, Ph.D. (místopředseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
doc. Mgr. Pavel Dvořák, Ph.D. (člen)

Supervisor’s report
Ing. Jiří Holub, Ph.D.

Diplomová práce Bc. Karolíny Knopfové se zabývá studiem produkce, izolace a charakterizace biologicky aktivních látek produkovaných kvasinkou Metschnikowia pulcherrima. Studentka práci logicky rozčlenila do několika hlavních celků. V teoretické části zpracovala rozsáhlou literární rešerši zaměřenou na daný mikroorganismus a jím produkované metabolity. Na ni navazovala experimentální část, ve které se studentka věnovala kultivaci kvasinky v různých měřítkách, optimalizaci extrakčních postupů sledovaných látek a jejich následné analýze pomocí řady moderních instrumentálních metod.
Významná část práce byla zaměřena na vývoj a optimalizaci extrakčního protokolu pro izolaci pigmentu pulcherriminu, kde studentka prokázala schopnost systematicky řešit experimentální problémy a kriticky vyhodnocovat dosažené výsledky. Dále se věnovala stanovení obsahu železa ve vzorcích, charakterizaci lipidového profilu, analýze sterolů a ubichinonu a izolaci exopolysacharidů, u nichž byl hodnocen jejich vliv na probiotické kmeny bakterií. Získané výsledky mají potenciální význam z hlediska biotechnologických aplikací.
Výsledky práce jsou přehledně zpracovány, vhodně diskutovány a zasazeny do kontextu aktuálních poznatků.
Na základě výše uvedeného hodnotím předloženou diplomovou práci jako kvalitní a přínosnou. Práci doporučuji k obhajobě a hodnotím ji známkou A.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Studium literatury a její zpracování A
Využití poznatků z literatury A
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Závěry práce a jejich formulace A
Využívání konzultací při řešení práce A
Celkový přístup k řešení úkolů A

Grade proposed by supervisor: A

Reviewer’s report
Ing. Simona Dzurendová, PhD

Predložená diplomová práca sa zaoberá aktuálnou problematikou produkcie a charakterizácie bioaktívnych metabolitov kvasinky Metschnikowia pulcherrima. V teoretickej časti autorka prináša systematický opis kvasiniek z hľadiska ich morfológie, metabolizmu a priemyselného využitia. Následne sa detailnejšie zameriava na rod Metschnikowia, jeho intracelulárne metabolity, pulcherrimin a exopolysacharidy. Študentka v práci približuje aplikáciu tohto mikroorganizmu a jeho extracelulárnych metabolitov v oblasti probiotík a prebiotík. Experimentálna časť je opísaná s metodickou presnosťou. Mám však výhradu k uvádzaniu množstva mikroelementového roztoku a roztokov železa v objemových jednotkách μL zásobného roztoku. Pre lepšiu porovnateľnosť by bolo vhodnejšie uvádzať finálnu koncentráciu daných prvkov priamo v kultivačnom médiu. Študentka si úspešne osvojila široké spektrum laboratórnych metodík vrátane kultivácie, extrakcie a stanovenia intra- aj extracelulárnych kvasinkových metabolitov. Prínosom práce je najmä úspešná optimalizácia extrakčných postupov pre získavanie pulcherriminu. V časti „Výsledky a diskusia“  oceňujem zaradenie krátkych zhrnutí cieľov pred samotnou prezentáciou nameraných hodnôt, čo zvyšuje prehľadnosť a čitateľnosť textu. Študentka získané dáta podrobne diskutuje, logicky ich konfrontuje s dostupnou literaturou a interpretuje biochemický význam pozorovaných javov. V práci nechýba ani kritické zhodnotenie možných metodických limitácií.
Práca je napísaná na odbornej a vysokej jazykovej úrovni. Svojím rozsahom a spracovaním spĺňa všetky požiadavky kladené na diplomovú záverečnú prácu a stanovené ciele boli splnené.
Prácu odporúčam k obhajobe a navrhujem celkové hodnotenie A.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Logické členění práce A
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Využití literatury a její citace A
Úroveň jazykového zpracování A
Formální úroveň práce – celkový dojem A
Závěry práce a jejich formulace A
Topics for thesis defence:
  1. Na základe čoho bol stanovený čas bioreaktorovej kultivácie na 180h? Bolo potrebné v priebehu kultivácie korigovať pH, prípadne v akom čase?
  2. Preukázali ste významný prebiotický potenciál EPS, u niektorých baktérii však nastala inhibícia rastu. Veľmi zaujímavý jav je pozorovaný pre Lactobacillus pentosus, kde pozorujeme oba efekty, inhibičný aj mierne stimulačný, v závislosti na pridávanem množstve. Ako by ste vysvetlili, že práve so zvyšujúcou sa koncentráciou EPS viabilita stúpa?
  3. V práci je pulcherrimin navrhovaný pre aplikáciu v biokontrole pred fytopatogennými mikroorganizmami. Akú aplikačnú formu by takýto prípravok mohol mať?

Grade proposed by reviewer: A

Reasons for publication postponement

Publication of the final thesis has been postponed in compliance with the provisions of Section 47b (4) of Act No. 111/1998 Coll., on the Higher Education Institutions and on amendments and supplements to other acts, as amended.

Based on innovative results that demonstrate publication potential in a scientific journal.

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová