Master's Thesis

Violacein pigment production and its biological effects in the genus Janthinobacterium

Final Thesis 2.96 MB

Author of thesis: Bc. Nikolai Dvornyi

Acad. year: 2025/2026

Supervisor: Ing. Eva Slaninová, Ph.D.

Reviewer: Ing. Simona Dzurendová, PhD

Abstract:

This diploma thesis focuses on the optimization of violacein production by bacteria of the genus Janthinobacterium, specifically Janthinobacterium lividum CCM 160 and CCM 1888, and simultaneously evaluates the possibility of polyhydroxyalkanoate (PHA) co-production. The influence of cultivation conditions, including medium composition, temperature, culture volume, and antibiotic addition, on the production of these metabolites was investigated.

The results showed that violacein production is strongly affected by the composition of the cultivation medium, particularly the availability of carbon sources, the presence of L-tryptophan, and trace elements. A significant effect was also observed with the addition of ampicillin, which led to a several-fold increase in violacein production, reaching a maximum concentration of approximately 36 mg/L in the CCM 160 strain. PHA production was highly dependent on cultivation conditions and was enhanced particularly at lower temperatures.

Antimicrobial assays confirmed a strong inhibitory effect of violacein against the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis, while its activity against Escherichia coli was limited. The obtained results highlight the importance of optimizing cultivation conditions for the efficient production of these biotechnologically valuable compounds.

Keywords:

Janthinobacterium; coproduction; violacein; polyhydroxyalkanoates; gas chromatography; spectrophotometry; optimization

Date of defence

25.05.2026

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaBznamka

Grading

B

Process of defence

1. Student seznámil členy komise s náplní a cílem diplomové práce. 2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci. 3. Student akceptoval všechny připomínky oponentky a na všechny otázky odpověděl v plné šíři. Diskuse: doc. Ing. Petr Sedláček, Ph.D. Přemýšleli jste o současné izolaci PHA a violaceinu? Jaká by byla separace těchto dvou produktů? Může violacein představovat přidanou hodnotu PHA? Uvažovali jste o SSF kultivaci? doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. Připomínka – příliš faktické hodnocení výsledků – chybí diskuze – proč, co se v rámci kultivace stalo. Proč má změna objemu v baňce vliv na produkci violaceinu? Pokud je nedostatek kyslíku, pomohlo by provzdušňování bioreaktoru? V práci diskutujete výtěžnost s jednotkou mg/l, jaké by byly vhodnější jednotky? Jakým způsobem bylo zpracováno statistické vyhodnocení? Jaké statistické metody by bylo vhodné použít, abychom mohli potvrdit statisticky významný rozdíl? Proč u grafů vztahujících se k vlivu teploty nemáte v grafech uváděny všechny testované bakteriální kmeny? prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. Máte potvrzené, že se jednalo pouze o čistý violacein nebo o směs s jeho deriváty? Uvažovali jste o další rozpouštědlech jako methanol, ethanol? Mohla by změna rozpouštědla vést k izolaci pouze čistého violaceinu? Mgr. Ondřej Vašíček, Ph.D. Souvisí produkce violaceinu s obranným mechanismem producenta? Můžou stresory ovlivnit rychlost růstu mikroorganismů a produkci? Student odpověděl na doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. V diskusi student prokázal velmi dobrou orientaci v dané problematice. Po diskusi následovalo hodnocení závěrečné práce. Diplomant prokázal velmi dobré odborné znalosti i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.

Language of thesis

Czech

Faculty

Fakulta chemická

Department

Institute of Food Science and Biotechnology

Study programme

Chemistry for Medical Application (NPCP_CHMA)

Specialization

Chemistry of Bioactive Substances (CHBL)

Composition of Committee

prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
doc. Ing. Petr Sedláček, Ph.D. (místopředseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
Mgr. Ondřej Vašíček, Ph.D. (člen)

Supervisor’s report
Ing. Eva Slaninová, Ph.D.

Ve své diplomové práci se Bc. Nikolai Dvornyi nejprve věnoval literární rešerši zaměřené především na bakterie rodu Janthinobacterium, biosyntézu pigmentu violaceinu, jeho biologickou aktivitu a souběžnou produkci violaceinu a polyhydroxyalkanoátů (PHA). Součástí rešerše byl také přehled metod extrakce violaceinu. Cílem práce bylo optimalizovat kultivační podmínky vedoucí k produkci pigmentu violaceinu u vybraných kmenů Janthinobacterium lividum CCM 160 a CCM 1888 a ověřit biologickou aktivitu izolovaného pigmentu. Součástí práce také bylo posouzení možnosti souběžné produkce polyhydroxyalkanoátů (PHA).

Velká část experimentální práce byla věnována samotné optimalizaci kultivačních podmínek, kdy student sledoval vliv složení kultivačního média, teploty, objemu kultivace a přídavku antibiotika na produkci violaceinu a PHA. Oceňuji zejména, že návrh kultivačních podmínek a celkovou koncepci kultivačních experimentů student připravil samostatně na základě studia odborné literatury. Dále byla provedena optimalizace extrakce violaceinu pomocí různých rozpouštědel a ultrazvuku, přičemž i zde student vycházel z poznatků odborné literatury. Součástí experimentální práce bylo rovněž testování antimikrobiální aktivity izolovaného pigmentu vůči bakteriím Bacillus subtilis a Escherichia coli.

Student si během řešení diplomové práce osvojil potřebné experimentální postupy v oblasti kultivace mikroorganismů, spektrofotometrického stanovení pigmentů a práce s analytickými metodami. K experimentální části práce přistupoval samostatně a prokázal schopnost orientace v odborné literatuře i návrhu experimentů. Rezervy práce spatřuji především v organizaci některých dílčích částí experimentální práce a ve zpracování výsledků, kdy vyhodnocení některých experimentů probíhalo až v pozdější fázi řešení diplomové práce. Tato skutečnost se částečně promítla také do kvality interpretace některých výsledků, diskuse a formulace závěrů práce.

Přes uvedené připomínky považuji diplomovou práci za kvalitně zpracovanou a přínosnou z pohledu dalšího studia produkce biologicky aktivního pigmentu violaceinu bakterií rodu Janthinobacterium. Diplomovou práci doporučuji k obhajobě a hodnotím známkou B.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Studium literatury a její zpracování A
Využití poznatků z literatury A
Kvalita zpracování výsledků B
Interpretace výsledků, jejich diskuse B
Závěry práce a jejich formulace B
Využívání konzultací při řešení práce B
Celkový přístup k řešení úkolů B

Grade proposed by supervisor: B

Reviewer’s report
Ing. Simona Dzurendová, PhD

Predložená diplomová práca sa zaoberá optimalizáciou biotechnologickej produkcie  pigmentu violaceínu u dvoch kmeňov baktérií Janthinobacterium lividum a súčasným hodnotením možnosti koprodukcie polyhydroxyalkanoátov (PHA). Teoretická časť je napísaná na odbornej úrovni, vrátane popisu metabolických dráh a faktorov ovplyvňujúcich produkciu biomasy, violaceínu a PHA. Taktiež sú poskytnuté detajly o biologickej aktivite violaceínu. V experimentálnej časti autor sledoval vplyv zloženia kultivačného média, teploty, objemu kultivácie a prídavku ampicilínu na produkciu biomasy a detajlne oboch sledovaných metabolitov. Kultivačná časť experimentálnej práce bola rozsiahla a študent venoval veľkú pozornosť diskusii rastových podmienok na nárast a zloženie biomasy, ktoré patrične porovnával s informáciami v literatúre. Oceňujem údaje OD a aj výťažok v g/L pre nárast biomasy. Ďalej práca zahŕňala optimalizáciu extrakčného postupu pomocou ultrazvuku, testovanie antimikrobiálnej aktivity a vizualizáciu buniek pomocou skenovacej transmisnej elektrónovej mikroskopie. 
Práca má dobrý základ, no jej celkovú úroveň by pozdvihla dôslednejšia formálna úprava. Odporúčam zamerať sa na korektúru textu, v ktorom sa miestami nachádzajú preklepy, gramatické chyby, chybné číslovanie citácií alebo nedokončené myšlienky. Pre lepšiu prehľadnosť a ľahšie porozumenie výsledkom by bolo prínosné venovať viac pozornosti ich prezentácii. Vítaným vylepšením by bolo napríklad prepojenie hodnôt violaceínu s tabuľkami biomasy a PHB, podrobnejšie popisy legiend a osí grafov (ideálne so zjednoteným rozsahom osí y pre porovnateľnosť OD). Taktiež by bolo dobré v metodike objasniť skratky GLY a GLU použité v tabuľke 11 a skontrolovať popis tabuľky 9.
Napriek formálnym nedostatkom práca Bc. Nikolaia Dvornyiho prináša cenné experimentálne dáta. Autor preukázal vysokú úroveň analytických, metodických a kritických výskumných zručností. Prácu odporúčam k obhajobe a celkovo hodnotím známkou B.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Logické členění práce A
Kvalita zpracování výsledků B
Interpretace výsledků, jejich diskuse B
Využití literatury a její citace A
Úroveň jazykového zpracování B
Formální úroveň práce – celkový dojem B
Závěry práce a jejich formulace A
Topics for thesis defence:
  1. V práci uvádzate, že prídavok ampicilínu vyvolal u baktérií stresovú odpoveď, ktorá významne stimulovala produkciu violaceínu. Aké iné typy stresov by mohli mať stimulačný efekt bez nutnosti pridávať antibiotiká do média? Aký dopad by predstavovalo používanie antibiotika v takomto rozsahu?
  2. Kultivácie trvali 168h. Na základe čoho bol vybraný práve tento čas, a ako by ste ho optimalizovali na základe výsledkov rastových kriviek?
  3. Ďalším krokom optimalizácie bioprocesu je upscale do bioreaktoru. Aké zloženie média, čas a teplotu pre produkciu violaceinu a PHB by ste navrhli na základe Vašich výsledkov? Ako by ste z bakteriálnej biomasy vyextrahovali oba produkty?

Grade proposed by reviewer: B

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová