Master's Thesis

Cultivation strategy for PHA production by thermophilic bacteria

Final Thesis 3 MB

Author of thesis: Bc. Karolína Jandová

Acad. year: 2025/2026

Supervisor: Ing. Iva Buchtíková, Ph.D.

Reviewer: Ing. Diana Černayová, Ph.D.

Abstract:

Polyhydroxyalkanoates (PHA) are polyesters of hydroxyalkanoic acids produced by microorganisms. These biopolymers are biodegradable and biocompatible, with properties closely resembling those of petroleum-based plastics. They have a wide range of applications but are limited by their high production cost. Thermophilic microorganisms, such as those from the genus Aneurinibacillus, may offer a solution. Their high cultivation temperature prevents contamination by mesophilic microorganisms, which reduces the requirements for sterility. The choice of cultivation strategy is an important step in the optimization of biotechnological processes. Therefore, this master’s thesis focuses on the study of cultivation strategies for the production of polyhydroxyalkanoates by the thermophilic bacterium Aneurinibacillus sp. AFN2.
In this thesis, three cultivation strategies are compared: batch, fed-batch, and pulse continuous cultivation. Different cultivation systems were also tested: Erlenmeyer flasks and the bioreactors Biosan RTS-1, Chi.Bio, and Multifors. The main focus of these experiments was the production of the heteropolymer P(3HB-co-4HB-co-3HV), using γ-butyrolactone as a precursor. Cultivations were performed using both complex and mineral media, with glucose as the carbon source. The production of polyhydroxyalkanoates was determined by gas chromatography.
Cultivation on complex media led to higher PHA production by Aneurinibacillus sp. AFN2. In batch cultivations, substrate limitation was reached by the 72 hours, and the produced PHA was subsequently consumed. Fed-batch cultivation prevented substrate limitation and resulted in higher production in Erlenmeyer flasks up to 87 %. The pulse continuous cultivation strategy appears promising (especially when using complex media) and led to high PHA production.

Keywords:

Polyhydroxyalkanoates (PHA), cultivation strategies, thermophilic bacteria, Aneurinibacillus

Date of defence

28.05.2026

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaAznamka

Grading

A

Process of defence

1. Studentka seznámila členy komise s náplní a cílem diplomové práce. 2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci. 3. Studentka akceptovala všechny připomínky oponentky a na všechny otázky odpověděla v plné šíři. Diskuse: prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. Zmínila jste možnou kontaminaci ve fermentorech, o jakou kontaminaci se podle Vás jednalo? Zmínila jste semi-sterilní režim kultivace, můžete to objasnit? prof. RNDr. Iva Burešová, Ph.D. Jak jsou výsledky převeditelné do výrobní praxe? Je reálné, že by se tento postup mohl používat ve velkém měřítku? prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D. Jak je možné PHA izolovat? Je nějaká levná cesta izolace? Studentka odpověděla na všechny doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. V diskusi studentka prokázala výbornou orientaci v dané problematice. Po diskusi následovalo hodnocení závěrečné práce. Diplomantka prokázala nejen výborné odborné znalosti, ale i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.

Language of thesis

Czech

Faculty

Fakulta chemická

Department

Institute of Food Science and Biotechnology

Study programme

Chemistry of Natural Products (NPCP_CHPL)

Composition of Committee

prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
prof. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D. (místopředseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Iva Burešová, Ph.D. (člen)
prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D. (člen)

Supervisor’s report
Ing. Iva Buchtíková, Ph.D.

Studentka Bc. Karolína Jandová vypracovala diplomovou práci na téma Kultivační strategie pro PHA produkci termofilními bakteriemi. Práce se zabývá aktuální problematikou biologicky odbouratelných polymerů, konkrétně polyhydroxyalkanoátů (PHA), a jejich produkcí pomocí termofilních mikroorganismů. Cílem práce bylo otestovat a optimalizovat různé kultivační strategie, ale také různé kultivační systémy, od kultivačních baněk až po různé typy bioreaktorů.

Studentka k řešení práce přistupovala velmi aktivně a samostatně. Od počátku projevovala iniciativu při plánování experimentů i při jejich realizaci a celkově odvedla velký objem práce. Během experimentální části prokázala schopnost pružně reagovat na vzniklé komplikace a hledat vhodná řešení. V průběhu práce bylo například nutné upravit původní experimentální plán a vynechat použití prekurzoru gama-butyrolactonu, což studentka dokázala dobře zohlednit v dalším postupu a pokračovat v práci bez zásadního narušení jejích cílů.

Studentka rovněž prokázala velmi dobrou laboratorní zručnost a pečlivost při provádění experimentů. Pracovala systematicky, jednotlivé kroky si dokázala dobře organizovat a získaná data průběžně vyhodnocovat. Oceňuji také její vytrvalost a schopnost dotahovat úkoly do konce i v situacích, kdy experimenty nepřinášely okamžitě očekávané výsledky.

V teoretické části práce studentka dobře pracovala s odbornou literaturou a relevantními zdroji. Dokázala se zorientovat v dané problematice a přehledně shrnout klíčové poznatky související s produkcí PHA a využitím termofilních bakterií. Tyto poznatky vhodně propojila s vlastní experimentální částí práce. Výsledky jsou prezentovány srozumitelně a odpovídají stanoveným cílům. Celkové zpracování práce je na výborné úrovni, text je logicky členěný a přehledný.

Předložená diplomová práce přináší zajímavé poznatky v oblasti kultivačních strategií pro produkci PHA a ukazuje potenciál termofilních mikroorganismů pro biotechnologické aplikace. Studentka v průběhu řešení prokázala jak odborné znalosti, tak i praktické dovednosti a aktivní přístup k práci. Práce byla rovněž zkontrolována z hlediska plagiátorství pomocí systému Theses.cz, přičemž zjištěná míra podobnosti činí 11 %. Tato hodnota odpovídá běžné shodě v citacích a popisech standardních metodických postupů, a práci lze proto považovat za originální. Celkově hodnotím práci velmi pozitivně, práci doporučuji k obhajobě a hodnotím stupněm A – výborně.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Studium literatury a její zpracování A
Využití poznatků z literatury A
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Závěry práce a jejich formulace A
Využívání konzultací při řešení práce A
Celkový přístup k řešení úkolů A

Grade proposed by supervisor: A

Reviewer’s report
Ing. Diana Černayová, Ph.D.

Diplomová práca študentky Bc. Karolíny Jandovej sa venuje Kultivačným stratégiam pre produkciu PHA s využitím termofilných baktérii.
Teoretická časť je spracovaná prehľadne a na dobrej odbornej úrovni. Autorka čerpá z rozmanitých zdrojov (97 citácií), text je ucelený, logicky štruktúrovaný a dobre čitateľný. Okrem charakterizácie polymérov PHA, ktoré sú produkované v živých bunkách, autorka zhrnula rôzne kultivačné stratégie pri produkcii PHA a to vrátane využitia odpadných zdrojov, aseptických podmienok, dvojfázovej fermentácie a fotoautotrofných kultúr. Ďalej boli podrobne opísané rôzne typy biotechnologickej produkcie vo fermentoroch, ktorým sa autorka venovala aj v experimentálnej časti. Okrajovo boli popísané aj extremofilné baktérie, s ktorými autorka taktiež pracovala počas experimentov.
V rámci formálnych a typografických úprav by som autorke vytkla Tabuľku č.4, v ktorej hodnoty nie sú zaokrúhlené na rovnaký počet desatinných miest. Avšak za výrazné pozitívum považujem použitie grafických znázornení experimentov, ktoré výrazne prispievajú k prehľadnosti práce.
V experimentálnej časti práce Bc. Jandová realizovala veľké množstvo experimentov s využitím rôznych kultivačných zariadení s cieľom otestovať optimálnu produkciu biomasy a biopolymérov PHA. Experimenty sú časovo náročné a pozostávajú z nevyhnutných optimalizačných krokov, ktoré sa z hľadiska použitého prístupu líšia. Úlohou bolo identifikovať viaceré kultivačné stratégie na biotechnologickú produkciu PHA.
Výsledky experimentov sú prehľadne opísané, zdiskutované a znázornené v tabuľkách a grafoch. Práca obsahuje jasné porovnanie rôznych typov médií (minerálneho a komplexného) a ich vplyvu na rast buniek a produkciu polymérov. Pri každom experimente bol zhodnotený jeho priebeh a jednotlivé hodnoty výťažnosti, teda produkcie PHA.
Diplomová práca spĺňa všetky body zadania. Autorka preukázala hlboké porozumenie danej problematiky, schopnosť kritického myslenia a samostatnej vedeckej práce. Prácu hodnotím stupňom A – výborne.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Logické členění práce A
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Využití literatury a její citace A
Úroveň jazykového zpracování A
Formální úroveň práce – celkový dojem A
Závěry práce a jejich formulace A
Topics for thesis defence:
  1. 1/ Z hľadiska biotechnologického využitia (najmä z pohľadu ceny a efektivity), ktorý proces kultivácie považujete za najvýhodnejší z hľadiska efektívnej produkcie PHA: vsádzková (batch), fed-batch alebo pulzná kultivácia? Zdôvodnite svoju odpoveď z pohľadu času produkcie, potrebných prídavkov substrátov a výťažnosti, ktorú ste v práci porovnávali.
  2. 2/ Ako ste pri malom objeme média v reaktoroch Biosan zabezpečili, aby nedochádzalo k postupnému vyparovaniu počas kultivácie pri teplote 50 °C a dobe kultivácie 72 hodín?
  3. 3/ Reaktor Chi.Bio pravdepodobne nie je optimálny na maximalizáciu výťažku PHA. V akých oblastiach, alebo typoch experimentov však môže byť jeho využitie prínosné?
  4. 4/ Vo Vašom experimente s bioreaktormi Multifors ste zmienili možnú kontamináciu baktérii. Keďže ste v práci používali termofily, pri ktorých ako jednu z najväčších výhod vyzdvihujete práve, že ku kontaminácii bežne nedochádza, ako a prečo si myslíte, že k tomu mohlo dôjsť?

Grade proposed by reviewer: A

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová