Master's Thesis

Use of primers specific for retrotransposon Cassandra for differentiation of Vaccinium species, and their detection in food

Final Thesis 3.86 MB

Author of thesis: Bc. Martina Brabcová

Acad. year: 2025/2026

Supervisor: Ing. Lenka Fialová, Ph.D.

Reviewer: prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D.

Abstract:

Species of the genus Vaccinium occur widely, and due to extensive breeding it is becoming increasingly difficult to distinguish them from each other based on morphological characteristics. The use of molecular methods such as real-time PCR with HRM analysis is fast and effective, but amplification conditions need to be optimized. This thesis was focused on optimizing the temperature profile of real-time PCR using three primer pairs (VcCass 2, VcCass 3, and VcCass 4) specific to the Cassandra retrotransposon. The primers were used to distinguish between bilberry (V. myrtillus), blueberry (V. corymbosum), and lingonberry (V. vitis-idaea). Subsequently, the sensitivity of the selected primers and their ability to differentiate other species of the genus Vaccinium (V. macrocarpon, V. oxycoccos, and V. uliginosum) were determined. The VcCass 2 primer pair demonstrated the best ability to differentiate all tested species and was subsequently successfuly used to confirm the presence of several Vaccinium species in various foods.

Keywords:

Vaccinium genus, real-time PCR, HRM analysis, Cassandra retrotransposon, freeze-dried fruit

Date of defence

25.05.2026

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaAznamka

Grading

A

Process of defence

1. Studentka seznámila členy komise s náplní a cílem diplomové práce. 2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci. 3. Studentka akceptovala všechny připomínky oponenta a na všechny otázky odpověděla v plné šíři. Diskuse: prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. Jaká omezení očekáváte při využití této metody v praxi? Zmínila jste transposon Cassandra, můžete objasnit o co se jedná? Jak tato část genomu funguje? Z jakého důvodu se na tyto sekvence cílí při návrhu primerů? Jak moc jsou specifické? Je možné je pak využít i třeba pro rozlišení na úrovni druhů? prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. Jaká je citlivost primerů k dané sekvenci? Jaké koncentrace DNA byly použity? Jakou roli hraje právě koncentrace DNA? Mgr. Ondřej Vašíček, Ph.D. Je známo, k čemu slouží retrotranspozon Cassandra v rostlinné buňce? Studentka odpověděla na všechny doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. V diskusi studentka prokázala výbornou orientaci v dané problematice. Po diskusi následovalo hodnocení závěrečné práce. Diplomantka prokázala nejen výborné odborné znalosti, ale i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.

Language of thesis

Czech

Faculty

Fakulta chemická

Department

Institute of Food Science and Biotechnology

Study programme

Chemistry for Medical Application (NPCP_CHMA)

Specialization

Chemistry of Bioactive Substances (CHBL)

Composition of Committee

prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
doc. Ing. Petr Sedláček, Ph.D. (místopředseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
Mgr. Ondřej Vašíček, Ph.D. (člen)

Supervisor’s report
Ing. Lenka Fialová, Ph.D.

Diplomová práce Martiny Brabcové navazuje na diplomovou práci Zdeňka Veselého řešenou v minulém akademickém roce. Studentka v rámci experimentů optimalizovala podmínky PCR pro několik párů primerů, sledovala jejich využitelnost pro rozlišení šesti druhů z rodu Vaccinium a otestovala též jejich využitelnost pro analýzu lyofilizovaného ovoce a výrobků z něj. Celková podobnost s jinými dokumenty je 5,1 %, podobné pasáže jsou ale tvořeny zejména názvy chemikálií a přístrojů, metodami nebo názvy kapitol.
Studentka k řešení práce přistupovala aktivně a při provádění experimentů projevila samostatnost a zručnost. Pozitivně hodnotím i přístup ke zpracování získaných dat, které bylo časově poměrně náročné a zahrnovalo využití softwaru, se kterým se studenti v rámci výuky příliš často nesetkávají. Studentka aktivně využívala konzultace při psaní všech částí práce, díky čemuž je předložená finální verze práce na velmi dobré úrovni. Práci doporučuji k obhajobě a hodnotím známkou A - výborně.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Studium literatury a její zpracování A
Využití poznatků z literatury A
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Závěry práce a jejich formulace A
Využívání konzultací při řešení práce A
Celkový přístup k řešení úkolů A

Grade proposed by supervisor: A

Reviewer’s report
prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D.

Diplomová práce Bc. Martiny Brabcové se zabývá aktuálním a odborně významným tématem využití primerů specifických pro retrotransposon Cassandra k rozlišení druhů rodu Vaccinium a jejich detekci v potravinách. Práce je velmi dobře strukturovaná, obsahuje rozsáhlou teoretickou část zaměřenou na problematiku PCR HRM, izolaci DNA a charakteristiku rodu Vaccinium, a experimentální část, která je metodicky propracovaná a systematicky zpracovaná.
Studentka se zaměřila na optimalizaci podmínek real time PCR s HRM analýzou a testování několika párů primerů. Experimentální část zahrnovala izolaci DNA, optimalizaci teplotních profilů, stanovení citlivosti a následnou aplikaci metody na reálné (komerční) potravinové vzorky. Výsledky jsou přehledně prezentovány a doplněny grafickými výstupy i statistickým vyhodnocením. Bylo prokázáno, že primery VcCass 2 umožňují spolehlivé rozlišení druhů rodu Vaccinium a jejich detekci v potravinách, což představuje prakticky využitelný výstup práce.
Práce však místy vykazuje méně rozvinutou diskusi výsledků, zejména ve smyslu hlubšího porovnání s publikovanými studiemi a širší interpretace získaných dat. U některých částí by bylo vhodné detailněji rozebrat limity metody (např. vliv inhibitorů nebo variabilitu vzorků).
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Logické členění práce A
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse B
Využití literatury a její citace A
Úroveň jazykového zpracování A
Formální úroveň práce – celkový dojem A
Závěry práce a jejich formulace A
Topics for thesis defence:
  1. Proč se primery VcCass 3 ukázaly jako nevhodné a jak by bylo možné jejich vlastnosti zlepšit?
  2. Jaké hlavní faktory ovlivňují rozlišovací schopnost HRM analýzy u rostlinných druhů?
  3. Jaká omezení očekáváte při aplikaci této metody na složitější potravinové matrice (např. směsi více druhů)?

Grade proposed by reviewer: A

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová