Bachelor's Thesis

Therapeutic use of nucleic acids in nanoparticles

Final Thesis 1.99 MB

Author of thesis: Bc. Patrik Břečka

Acad. year: 2025/2026

Supervisor: prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D.

Reviewer: Ing. Helena Hudečková, Ph.D.

Abstract:

This bachelor’s thesis focuses on the study of nucleic acid encapsulation into liposomal and chitosan-modified particles, as well as the monitoring of the effects of various temperature conditions on their stability during storage. Nucleic acids have a wide range of applications in medicine, from oncology and virology to genome editing. However, their use is significantly limited by their low stability under physiological conditions. To improve stability, prolong the release of the active substance, and enable targeted delivery, carrier systems are employed. As part of the optimization of nanoparticle preparation with nucleic acids, plasmid deoxyribonucleic acid of varying sizes and conformations was isolated in the experimental section and subsequently encapsulated into liposomal particles, some of which were coated with chitosan. The prepared formulations were characterized using dynamic light scattering to determine particle size and polydispersity, while the zeta potential was also measured as an indicator of stability of prepared formulations. The efficiency of encapsulation was determined using horizontal gel electrophoresis. Furthermore, changes in particle properties over time were monitored during both short-term and long-term storage at temperatures of 4 °C, 25 °C, and 37 °C. The amount of released pDNA was also analysed over time using horizontal gel electrophoresis. The prepared liposomes exhibited suitable properties for potential therapeutic applications and good temporal stability, whereas chitosan-modified particles did not reach these parameters. It was also found that sonication may have a destructive effect on pDNA and therefore may not be suitable for the preparation of these nanoparticles.

Keywords:

Liposomes, chitosan-coated liposomes, encapsulation, storage, nucleic acids, DNA

Date of defence

15.06.2026

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaAznamka

Grading

A

Process of defence

1. Student seznámil členy komise s náplní a cílem bakalářské práce. 2. Byly přečteny posudky na bakalářskou práci. 3. Student akceptoval všechny připomínky oponentky a na všechny otázky odpověděl v plné šíři. Diskuse: prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. Jak jste měl v plánu kvantifikovat uvolněnou DNA ve vzorku? Izoloval jste plazmidovou DNA? Docházelo k transformaci? Jakou měl izolovaný plazmid velikost? Nedošlo při fragmentaci ke vzniku lepivých konců? Jakou metodou byly připravovány částice? Měřili jste koncentraci DNA před a po enkapsulaci? Jak? doc. Ing. Filip Mravec, Ph.D. Doporučení k úpravě spektrofotometrické techniky, aby nedocházelo k interferencím. prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. Jaké jiné metody než sonifikace, je možné použít pro tvorbu částic? Jak probíhá vstřikování ethanolem při tvorbě částic? Bylo by možné použít mikrofluidní míchání? Jak funguje hydratace na tenké vrstvě? doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. Na elektroforegramu v diskuzi oponentních otázek je zvláštní útvar kanálkovitého tvaru, čím mohl být způsoben? Student odpověděl na všechny doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. V diskusi student prokázal výbornou orientaci v dané problematice. Po diskusi následovalo hodnocení závěrečné práce. Student prokázal nejen výborné odborné znalosti, ale i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.

Language of thesis

Czech

Faculty

Department

Study programme

Chemistry for Medical Application (BPCP_CHMA)

Composition of Committee

prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
doc. Ing. Filip Mravec, Ph.D. (místopředseda)
prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)

Supervisor’s report
prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D.

Bakalářská práce Patrika Břečky vykazuje velmi nízkou míru podobnosti s jinými dokumenty (pod 1 %), což svědčí o samostatném a originálním přístupu ke zpracování tématu. Práce je zaměřena na problematiku enkapsulace nukleových kyselin do lipozomálních a chitosanových nanočástic a jejich potenciální terapeutické využití, přičemž vhodně propojuje teoretickou část s experimentálním přístupem. Student prokázal dobrou orientaci v dané problematice a zvládl realizaci i interpretaci poměrně náročných experimentů; i přes určité komplikace v metodické oblasti se s prezentací výsledků vyrovnal dobře a dokázal je srozumitelně zpracovat. Práce mohla být poskytnuta k revizi vedoucímu v dřívější fázi řešení, což by umožnilo některé aspekty vylepšit. Celkově práce splňuje požadavky kladené na bakalářskou práci, doporučuji ji k obhajobě a navrhuji hodnocení výborně (A).
Evaluation criteria Grade
Quality of the Results B
Interpretation and Discussion of the Results B
Conclusions and Their Formulation A
Use of Consultations during the Preparation of the Thesis B
Overall Approach to the Assigned Tasks A
Fulfilment of the Assignment Requirements A
Study and Processing of the Literature A
Use of Knowledge Gained from the Literature A

Grade proposed by supervisor: A

Reviewer’s report
Ing. Helena Hudečková, Ph.D.

Předložená práce studenta Patrika Břečky se zabývá aktuální a velmi perspektivní problematikou využití nukleových kyselin v nanomedicíně, konkrétně jejich enkapsulací do lipozomálních a chitosanem modifikovaných nanočástic a hodnocením stability těchto systémů.
Zadání práce bylo splněno ve všech jeho bodech. Autor provedl rozsáhlou literární rešerši zaměřenou na nukleové kyseliny a jejich terapeutické využití, popsal různé typy nanočástic a analyzoval jejich aplikace. Současně realizoval experimentální část zaměřenou na enkapsulaci pDNA a vyhodnotil vliv velikosti, konformace a podmínek skladování na vlastnosti vzniklých částic.
Práce je logicky a přehledně strukturována do jednotlivých kapitol. Teoretická část poskytuje dostatečný základ pro pochopení experimentální problematiky, i když místy by mohla být více provázána s praktickou částí a mírně zestručněna. Experimentální část je systematicky členěna a popis postupů je dostatečně detailní, což umožňuje reprodukovatelnost experimentů. Kapitola výsledků a diskuse je rozsáhlá a obsahuje velké množství dat, která jsou prezentována v tabulkách a grafech.
Kvalita zpracování výsledků je na dobré úrovni. Autor využívá vhodné analytické metody, jako je dynamický rozptyl světla, stanovení zeta potenciálu a gelová elektroforéza, a výsledky interpretuje s ohledem na jejich význam pro stabilitu a využitelnost nanočástic. Pozitivně lze hodnotit systematické sledování změn vlastností částic v čase a při různých teplotách. Na druhou stranu se v datech objevuje poměrně vysoká variabilita, zejména u enkapsulační účinnosti, která v některých případech vykazuje i záporné hodnoty. Tyto skutečnosti poukazují na určité limity zvolené metodiky.
Interpretace výsledků je většinou logická a podpořená literárními zdroji. Autor správně identifikuje klíčové problémy, jako je fragmentace DNA během sonikace nebo nedostatečná stabilita chitosomů. Diskuse je poměrně podrobná, nicméně místy by mohla být kritičtější, zejména při vysvětlování neobvyklých výsledků, jako jsou zmíněné záporné hodnoty enkapsulační účinnosti. Pozitivně hodnotím návrhy týkající se možných vylepšení experimentů a směrů dalšího výzkumu.
Využití literatury je na velmi dobré úrovni. Autor pracuje s rozsáhlým množstvím relevantních zdrojů, které vhodně cituje a začleňuje do textu. Literární rešerše je dostatečně široká a poskytuje dobrý přehled o řešené problematice. Jazyková úroveň práce je dobrá, text je srozumitelný a odborně formulovaný, i když se v něm občas vyskytují drobné stylistické nepřesnosti.
Formální stránka práce je na poměrně dobré úrovni, ačkoliv se v práci vyskytují drobné typografické chyby. Práce obsahuje všechny požadované náležitosti, grafy a tabulky jsou přehledné a vhodně doplňují text. Práce působí dobrým celkovým dojmem, i když některé grafické prvky by mohly být lépe upraveny pro snazší orientaci v prezentovaných datech. Závěry práce odpovídají získaným výsledkům a jsou formulovány srozumitelně.
Celkově lze předloženou práci hodnotit jako kvalitně zpracovanou bakalářskou práci, která splňuje požadované cíle a prokazuje schopnost autora samostatně řešit odborný problém jak na teoretické, tak na experimentální úrovni. Ačkoliv se v práci vyskytují drobné chyby, tak to nesnižuje celkovou kvalitu. Cíle vytyčené v zadání byly splněny, práci proto doporučuji k obhajobě a hodnotím stupněm A (výborně).
Evaluation criteria Grade
Fulfilment of the Assignment Requirements A
Logical Structure of the Thesis A
Quality of the Results B
Interpretation and Discussion of the Results B
Use of Literature and Citations A
Language Quality A
Overall Formal Quality of the Thesis B
Conclusions and Their Formulation A
Topics for thesis defence:
  1. Jak by bylo možné eliminovat interferenci fosfolipidů při stanovení enkapsulační účinnosti? Byla Vámi zvolená metoda dostatečně citlivá nebo by bylo vhodné zkusit i jiné metody a případně jaké?
  2. V práci uvádíte, že záporný zeta potenciál chitosomů svědčí o nedostatečné adsorpci chitosanu na povrch lipozomů. Tato interpretace však vychází výhradně z měření zeta potenciálu. Jakou alternativní analytickou metodu byste navrhoval pro ověření adsorpce chitosanu?
  3. V metodice stanovení postupného uvolňování pDNA (kap. 4.3.6.1) uvádíte, že v každém časovém bodě byl odebrán alikvót 50 μl supernatantu. Byl celkový objem vzorku po každém odběru doplňován čerstvým PBS, nebo se postupně snižoval? Jak případný úbytek objemu ovlivňuje interpretaci výsledků uvolňování v čase?

Grade proposed by reviewer: A

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová