Bachelor's Thesis

Optimization of Cholesterol Analysis Obtained from Cell Lines

Final Thesis 5.71 MB

Author of thesis: Bc. Adriena Jedličková

Acad. year: 2025/2026

Supervisor: Ing. Markéta Laštovičková, Ph.D.

Reviewer: Ing. Janette Bobáľová, CSc.

Abstract:

Cholesterol and its metabolites play a crucial role in numerous cellular processes, including cellular signalling. Multiple studies show that cellular cholesterol levels may be one of the key factors in the development of cancer, making cholesterol a potential diagnostic marker and therapeutic target. Therefore, this bachelor’s thesis is focused on the development and optimization of an analytical method for the determination of free cholesterol and selected cholesteryl esters in animal cells. Subsequently lipidomic changes in macrophages (specialized cells engulfing and digesting pathogens) and oral squamous cell carcinoma (OSCC; a common malignancy affecting the head and neck region) were studied. The theoretical part of the thesis summarizes methods for lipid isolation and separation, with an emphasis on the cholesterol characterization using liquid chromatography and mass spectrometry (LC-MS). The experimental part involves the optimization of the cultivation conditions of selected cell lines (ARPE, THP-1, OSCC) and subsequent protocol for lipid extraction. To verify the suitability of the chosen analytical method for detecting qualitative and quantitative changes in the lipid profile, extracts from control cells and cells treated with acetylated low-density lipoprotein (AcLDL) were compared using Oil Red staining and LC-MS analysis. Incubation with AcLDL led to increased lipid accumulation, especially in THP-1 macrophages, which was confirmed by both methods. While Oil Red staining demonstrated changes in total lipids and macroscopic cellular alterations, targeted analysis using LC-ESI-QQQ-MS allowed for the precise determination of concentration changes in specific lipid species (e.g. cholesterol ester 18:1). The preliminary data obtained serve as a basis for a standardized protocol intended for further research into cholesterol metabolism and its role in the pathophysiology of OSCC.

Keywords:

cholesterol, cholesteryl esters, cell culture, liquid chromatography, mass spectrometry, oral squamous cell carcinoma

Date of defence

10.06.2026

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaAznamka

Grading

A

Process of defence

Studentka v prezentaci představila náplň a zásadní závěry své bakalářské práce. Následovalo čtení posudků vedoucí a oponentky a byly zodpovězeny položené otázky. V pokračující diskuzi byly položeny dotazy: doc. MVDr. H. Zlámalová Gargošová Ph.D. – Jsou poznatky zjištěné v práci přenositelné na jiné typy karcinomů? doc. Mgr. M. Vašinová Galiová, Ph.D. – Zaměříte se na experimenty vlivu nanočástic Pb na živé organismy? Má expozice vliv na distribuci prvků v metaloproteinech? Proč z původního počtu buněk v počátku dále vyhodnocujete pomocí koncentrací? Jaký je praktický postup získávání cholesterolu z buněk? Studentka odpověděla na všechny doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuze k dané problematice vzneseny. Předvedla, že má výborný přehled v řešené problematice, a to jak z teoretického, tak praktického hlediska. Po diskusi následovalo hodnocení závěrečné práce. Studentka prokázala výbornou orientaci v dané problematice i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.

Language of thesis

English

Faculty

Department

Study programme

Applied Analytical, Environmental and Forensic Chemistry (BKCP_AAEFCH)

Composition of Committee

doc. MVDr. Helena Zlámalová Gargošová, Ph.D. (předseda)
doc. Mgr. Renata Komendová, Ph.D. (člen)
doc. Mgr. Michaela Vašinová Galiová, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Jozef Krajčovič, Ph.D. (místopředseda)
doc. Ing. Jitka Malá, Ph.D. (člen)

Předložená bakalářská práce se zabývá charakterizací cholesterolu pomocí moderních analytických postupů. Zvolené téma přináší zajímavé experimentální výsledky ve stále aktuálnější oblasti lipidomiky. Význam této práce dokládá její začlenění do rozsáhlého grantového projektu GA ČR a její realizace ve spolupráci s několika výzkumnými institucemi, konkrétně s Ústavem analytické chemie AV ČR a Ústavem živočišné fyziologie a genetiky AV ČR.
Po formální a stylistické stránce považuji práci za velmi dobře zvládnutou. Předložený text je sepsán v anglickém jazyce a je, dle mého názoru, přehledný, srozumitelný a vykazuje dobrou gramatickou i grafickou úroveň. Svým rozsahem (122 stran) práce překračuje standardní požadavky. Za zdařilou považuji interpretaci dosažených výsledků, zejména zařazení přehledných tabulek a obrázků, a statistické vyhodnocení získaných výsledků.
Bohatý seznam použité literatury, který využila studentka nejen v teoretické části práce, ale i během diskuze svých výsledků, svědčí o pečlivé rešeršní práci.
Součástí posudku vedoucí diplomové práce není pouze zhodnocení odevzdaného rukopisu, ale i posouzení celkového přístupu autorky. Technicky i metodicky zvládla jak biologické postupy (pasážování, kultivace a ovlivnění buněk, MTT assay), tak následnou izolaci lipidů, LC-MS analýzu a vyhodnocení dat. Vzhledem k časové náročnosti biologických experimentů oceňuji dobrý time-management a dodržování domluvených termínů. Díky tomu dokázala bakalantka charakterizovat estery cholesterolu, jejichž kvantifikace v reálných vzorcích je obtížná. Získané výsledky mají publikační potenciál  a již byly (a budou) dále prezentovány na mezinárodních konferencích.
Závěr posudku
Studentka prokázala schopnost začlenit se do výzkumného týmu, pracovat s moderními analytickými metodami a propojit teoretické poznatky s praktickým experimentem.
S ohledem na výše uvedené konstatuji, že bakalářská práce Adrieny Jedličkové splňuje požadavky zadání a vykazuje dobrou odbornou úroveň. Práci doporučuji k obhajobě a navrhuji klasifikační stupeň „A“ (výborně).
Evaluation criteria Grade
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Závěry práce a jejich formulace A
Využívání konzultací při řešení práce A
Celkový přístup k řešení úkolů A
Splnění požadavků zadání A
Studium literatury a její zpracování A
Využití poznatků z literatury A

Grade proposed by supervisor: A

Reviewer’s report
Ing. Janette Bobáľová, CSc.

Předložená bakalářská práce se zabývá velmi aktuální a vědecky významnou problematikou vývoje a optimalizace analytické metody pro stanovení volného cholesterolu a vybraných esterů v živočišných buňkách. Vyvinutá metodika byla následně využita ke studiu změn lipidového profilu makrofágů a analýze cholesterolu v buňkách dlaždicobuněčného karcinomu dutiny ústní, tedy zhoubného nádoru postihujícího oblast hlavy a krku. Práce vhodně propojuje analytickou chemii s biomedicínským výzkumem a zároveň vytváří kvalitní metodický základ pro navazující výzkum v této perspektivní oblasti.
Studentka během řešení bakalářské práce prokázala výborný přehled o dané problematice. Teoretická část je zpracována na dobré odborné úrovni, vyznačuje se logickou strukturou a přehledným uspořádáním. Poskytuje ucelený souhrn a zahrnuje biologické charakteristiky studovaných buněčných modelů i principy použitých analytických metod.
Experimentální část je zpracována mimořádně pečlivě. Autorka prokázala velmi dobrou znalost metodiky a schopnost kriticky hodnotit jednotlivé experimentální kroky. Za velmi přínosné považuji vytvoření komplexního analytického postupu zahrnujícího optimalizovanou kultivaci buněk, účinnou extrakci lipidů a jejich citlivou a reprodukovatelnou detekci pomocí LC-MS.
Po formální stránce je práce zpracována na vysoké úrovni. Text je přehledně uspořádán, dobře strukturován a jazykový projev je odborný a srozumitelný. Získané výsledky jsou prezentovány přehledným způsobem. Obrázky, grafy i tabulky jsou vhodně zařazeny, kvalitně zpracovány a adekvátně doplňují textovou část práce. Za velmi cenné považuji snahu propojit analytická data s fyziologickými procesy v organismu a poukázat na potenciální význam získaných poznatků pro další výzkum.
Celkově hodnotím bakalářskou práci jako mimořádně kvalitně zpracovanou. Vyniká svou odbornou úrovní, experimentálním zpracováním i kvalitní interpretací získaných výsledků, přičemž v mnoha ohledech převyšuje běžné požadavky kladené na bakalářské práce.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Logické členění práce A
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Využití literatury a její citace A
Úroveň jazykového zpracování A
Formální úroveň práce – celkový dojem A
Závěry práce a jejich formulace A
Topics for thesis defence:
  1. 1. Proč jste sledovali pouze vybrané cholesterol estery a ne širší spektrum lipidů?
  2. 2. Proč po expozici acLDL došlo pouze k mírnému nárůstu volného cholesterolu (FC), zatímco hladiny cholesterol esterů (CEs) vzrostly několikanásobně? Přestože je tento jev v literatuře zdokumentován [161, 195, 203], uvítala bych podrobnější vysvětlení mechanismů, které vedou k výrazně vyšší akumulaci CE ve srovnání s FC (Figure 24).
  3. 3. Proč je CE 18:1 v buňkách majoritní?
  4. 4. Proč jsou cholesterol estery ukládány do lipidových kapének místo volného cholesterolu?
  5. 5. Jaké další experimenty by mohly potvrdit souvislost mezi akumulací lipidů a malignitou SCC-25 buněk?
  6. 6. Jaké byly důvody pro použití MRM na trojitém kvadrupólu místo HRMS a jaké jsou mezi těmito přístupy hlavní rozdíly?
  7. 7. Jaká jiná separační technika kapalinové chromatografie by mohla být použita pro analýzu lipidů?
  8. 8. Jak by se mohly výsledky lišit při použití jiné nádorové linie? Za přínosné by bylo také porovnání lipidového profilu buněk SCC-25 s normálními keratinocyty dutiny ústní, které by mohlo objasnit, zda je pozorovaná akumulace cholesterol esterů charakteristickým znakem nádorového fenotypu.

Grade proposed by reviewer: A

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová