Master's Thesis

Correlative methods for live cell microscopy

Final Thesis 5.43 MB Appendix 3.56 MB

Author of thesis: Ing. Lucie Korpasová

Acad. year: 2024/2025

Supervisor: Ing. Zbyněk Dostál, Ph.D.

Reviewer: Ing. Petr Jákl, Ph.D.

Abstract:

The combination of holographic microscopy with a low-coherence light source and confocal fluorescence microscopy enhances the capabilities of advanced live-cell imaging and real-time monitoring of dynamic biological processes. A newly developed confocal fluorescence module based on a DMD chip has been designed as an add-on unit for the hiQPI microscope. During the initial testing phase, experiments were conducted to verify the module’s basic functionality, focusing on fluorescence detection, depth selectivity, and lateral resolution. The results confirmed the system’s operational capability but revealed limited light efficiency. This limitation can be addressed through the use of a more powerful illumination source, a more sensitive detection
system, or a more efficient scanning method. Based on the experimentally validated parameters, a mechanical integration concept was developed for incorporation into the hiQPI system. Optical simulations in Zemax were performed to optimize the distance between the tube lens and the sample in order to avoid beam clipping. The project also includes a detailed mechanical design in SolidWorks, featuring precision adjustment mechanisms compatible with both the hiQPI microscope and the confocal module. To verify the design, the components were fabricated using 3D printing and integrated into the mechanical assembly.

Keywords:

holographic microscopy, confocal microscopy, fluorescence microscopy, correlative imaging, opto-mechanical design, digital light processing

Date of defence

11.06.2025

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaAznamka

Grading

A

Process of defence

Po otázkách oponenta bylo dále diskutováno: Uvažovali jste o Wilsonově uspořádání konforkálního mikroskopu? Jak bude prováděno korelativní měření. Způsob justáže kamery. Studentka na otázky odpověděla.

Language of thesis

Czech

Faculty

Department

Study programme

Precise Mechanics and Optics (N-PMO-P)

Composition of Committee

prof. RNDr. Tomáš Šikola, CSc. (předseda)
prof. RNDr. Jiří Spousta, Ph.D. (místopředseda)
prof. RNDr. Pavel Zemánek, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Ivan Křupka, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Petr Dub, CSc. (člen)
prof. RNDr. Jiří Petráček, Dr. (člen)
prof. RNDr. Radim Chmelík, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Miroslav Kolíbal, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Jindřich Mach, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Petr Bábor, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Radek Kalousek, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Pavel Pořízka, Ph.D. (člen)
Ing. Petr Jákl, Ph.D. (člen)
RNDr. Antonín Fejfar, CSc. (člen)

Supervisor’s report
Ing. Zbyněk Dostál, Ph.D.

Po obsahové i grafické stránce je diplomová práce zdařilá. Studentka se ve své práci zaměřila na testování a konstrukční úpravy konfokálního fluorescenčního modulu, určeného pro integraci do mikroskopu hiQPI. Stávající modul pečlivě seřídila a pro usnadnění této činnosti doplnila mechanickou sestavu o vlastní konstrukční prvky. Modul testovala jak v režimu epi-fluorescenčním, tak v režimu konfokálním, pro který rovněž sestavila vlastní skenovací software. V rámci experimentální části změřila příčné i osové rozlišení modulu, výsledky vyhodnotila a na jejich základě dospěla k závěru, že modul je vhodný k integraci do mikroskopu hiQPI. Navrhla také konkrétní konstrukční úpravy a optimalizovala optickou cestu pomocí simulačního softwaru Zemax.

Lucie Korpasová přistupovala k řešení diplomové práce odpovědně a systematicky. Cíle práce splnila v plném rozsahu. Prokázala schopnost správně interpretovat naměřená data a na jejich základě navrhnout technická zlepšení. Upravený modul byl následně vyroben a úspěšně integrován do mikroskopu hiQPI. Jako vedoucí práce hodnotím tuto diplomovou práci známkou výborně – A.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků a cílů zadání A
Postup a rozsah řešení, adekvátnost použitých metod A
Vlastní přínos a originalita B
Schopnost interpretovat dosažené výsledky a vyvozovat z nich závěry B
Využitelnost výsledků v praxi nebo teorii A
Logické uspořádání práce a formální náležitosti B
Grafická, stylistická úprava a pravopis B
Práce s literaturou včetně citací A
Samostatnost studenta při zpracování tématu A

Grade proposed by supervisor: A

Reviewer’s report
Ing. Petr Jákl, Ph.D.

Autorka se v diplomové práci zabývá integrací konfokálního fluorescenčního modulu do holografického mikroskopu. Navazuje na předchozí návrh modulu a přidáním justážních prvků a mechanizmů optimalizuje práci funkčního celku.

V práci je minimum překlepů (i když tedy jeden je shodou okolností přímo v nadpise na titulní stránce) a obrázky jsou z grafického hlediska dobré kvality. Obsah práce je původní a podobnosti indikované automatickou kontrolou plagiátů jsou na přijatelné úrovni.

V práci jsou (většinou drobné) nedostatky v obrázcích, např. u Zernikova kontrastu (obr. 1.11) je místo mezikruží nakreslena apertura. V optických schématech je pouze optická osa a chybí marginální paprsky, takže se čtenář špatně orientuje ve funkci systému. V grafu na obr. 3.17 jsou naměřené body spojené splajny – vhodné je buď proložit teoretickou závislost průběhu nebo spojit body přímými segmenty. Navíc je tam vložena úsečka FWHM, ovšem ve výšce 0,6 místo 0,5 (a nedotýká se křivky).

Text je místy nejasný – proč jsou na obr. 3.11 proužky a proč tento obrázek s proužky „jednoznačně potvrzuje funkčnost“ fluorescenčního zobrazování? Při prvním použití zkratky je nutné její význam specifikovat – např. u zkratek DAPI, FITC a TRITC by mělo být přinejmenším zmíněno, že jde o fluorescenční barviva. Proč se při měření kanálem FITC počítá Airyho disk (vztah 3.2, str. 37) z vlnové délky 550 nm, když je tento fluorofor excitován 480 nm?

Práce s literaturou je na dobré úrovni a všechny relevantní prameny jsou ocitovány podle normy ISO 690.

Odborná činnost na diplomovém projektu je na vynikající úrovni. Studentka dokázala během závěrečné práce navrhnout úpravy fluorescenčního modulu, přidat justážní prvky, provést paprskovou analýzu a ověřit funkčnost. Výkresová dokumentace je pečlivě provedená a má všechny náležitosti. Po kompletaci prototypu z 3D tisku umístila modul k stávající sestavě mikroskopu, připravila základní verzi software pro projekci amplitudových masek a provedla pilotní experimenty.

Studentka splnila všechny body zadání a dokázala v termínu celý projekt dokončit a funkci modulu ověřit. Práce má méně významné logické a formální nedostatky v popisové části. Při hodnocení jsem přihlédl k vysoké úrovni praktické části, práci hodnotím celkově A a doporučuji k obhajobě.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků a cílů zadání A
Postup a rozsah řešení, adekvátnost použitých metod A
Vlastní přínos a originalita A
Schopnost interpretovat dosaž. výsledky a vyvozovat z nich závěry B
Využitelnost výsledků v praxi nebo teorii A
Logické uspořádání práce a formální náležitosti C
Grafická, stylistická úprava a pravopis B
Práce s literaturou včetně citací A
Topics for thesis defence:
  1. U popisu inline holografie na str. 19 zmiňujete phase shifting. Jakým způsobem je možné fázi posunout?
  2. Ve vztahu 3.7 uvádíte teoretickou FWHM optické intenzity ve směru osy z. Není tam uveden pramen. Z čeho tento vztah vychází?
  3. Zařízení DMD může pracovat ve více režimech – black/white s vysokou frekvencí a šedotónové zobrazení využívající pulzní modulaci (PWM) s frekvencí řádově nižší. V jakém režimu pracujete v konfokálním modulu? Využíváte nebo plánujete nějak využít šedotónovou aperturu? Mohla by být v konfokálním modulu k něčemu užitečná?

Grade proposed by reviewer: A

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová