Bachelor's Thesis

Preparation and characterization of temperature sensitive liposomes

Final Thesis 1021.71 kB

Author of thesis: Bc. Richard Struhár

Acad. year: 2024/2025

Supervisor: doc. Ing. Filip Mravec, Ph.D.

Reviewer: Ing. Ivana Málková

Abstract:

Temperature-sensitive liposomes (TSLs) represent an attractive platform for the delivery of controlled-release biologically active agents, whereby upon a slight increase in temperature, their lipid bilayer undergoes a phase transition and thus becomes more permeable to the encapsulated content. This work focuses on the preparation, characterization, and functional testing of TSLs based on phospholipid dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) with the addition of different lysolipid monopalmitoylphosphatidylcholine (MPPC) concentrations. Compositions both with and without sodium dilauroylglycerophosphate (PA) were chosen.
In the first stage, vesicles were prepared by the thin lipid film hydration method (for different compositions of DPPC:PA:MPPC) at a total lipid concentration of 5 mmol/dm3. Subsequently, they were unilamellarized by 15-fold extrusion through a 100 nm membrane. Size and PDI (polydispersity index) were determined by DLS (dynamic light scattering), zeta potential by ELS (electrophoretic light scattering). The phase transitions of the membranes were monitored by fluorescence spectrometry, which measured anisotropy with two probes DPH (diphenylhexatriene) and its derivative TMA-DPH (trimethylammonium diphenylhexatriene) at temperatures between 10 and 70 °C. The kinetics of the encapsulated hydrophilic calcein was tested on the most promising 90:10 mol. % composition (DPPC:Lyso PC).
Samples with 10 mol. % Lyso-PC and 90 mol. % DPPC were monodisperse, Z-average was around 125 nm, PDI < 0.07, and surface charge was neutral (ζ potential = 3 mV). Anisotropy measurements showed an inflection point of Tm = 37.5 ± 0.5 °C. The width of the phase transition (x0 ± 2dx) was 34-41 °C corresponding to the range of mild hyperthermia. However, the expected rapid release of the encapsulated calcein was not achieved when heated to 45 °C, after 24 h, < 5 % of the calcein had escaped. The results of this work suggest that transient pores are formed only during the phase transition and disappear after the transition to the liquid-crystalline phase.
In this work, a composition of 90:10 mol. % (DPPC:MPPC) was selected as a suitable base for low-temperature TSL. Further investigation of the membrane properties during the phase transition will be required to reproduce the rapid release of the contents when a certain temperature is reached.

Keywords:

DPPC, temperature-sensitive liposomes, lysolipid, membrane phase transition, fluorescence anisotropy, membrane fluidity, dynamic light scattering (DLS), release kinetics

Date of defence

12.06.2025

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaAznamka

Grading

A

Process of defence

Obhajoba bakalářské práce proběhla podle následujícího schématu: prezentace studenta-vyjádření vedoucí/ho-oponentský posudek-reakce na posudek-diskuse s komisí. Student přednesl výborný výtah výsledků své práce, řádně zodpověděl všechny dotazy oponentské i členů komise, pohotově reagoval na připomínky. V diskusi tak student prokázal výbornou schopnost orientace v teoretických i praktických základech problematiky práce. Komise zhodnotila jeho práci celkově jako výbornou. Klučáková: Jak jste určil počáteční koncentraci kalceinu při uvolňování? Dzik: Prosím upřesněte metodiku stanovení uvolněného kalceinu. Krčma: Jaké jsou nejistoty uvedených výsledků?

Language of thesis

Slovak

Faculty

Department

Study programme

Chemistry and Chemical Technologies (BPCP_CHCHTE)

Composition of Committee

prof. Ing. Martina Klučáková, Ph.D. (předseda)
doc. Ing. Vojtěch Enev, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. František Krčma, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Zdenka Kozáková, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Petr Dzik, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Filip Mravec, Ph.D. (místopředseda)

Supervisor’s report
doc. Ing. Filip Mravec, Ph.D.

Student Richard Struhár předkládá bakalářskou práci na téma teplotně senzitivních liposomálních systémů, což je aktuálně velmi zajímavé téma z hlediska formulace nosičových systémů biologicky aktivních látek. Student, kterého jsem převzal po kolegovi, který práci zadával, pracoval pečlivě a samostatně a hojně využíval konzultace. Problematika enkapsulace hydrofilních látek do liposomů a jejich uvolňování teplotně indukovanými póry není jednoduchá a bylo nutné překonat spoustu překážek, neboť se látky z počátku uvolňují v nanomolárním množství, což znemožňuje použití absorpční spektrofotometrii. Fluorescence studované látky je pak silně ovlivněna svým prostředím, a proto bylo nutné použít pokročilou metodu fluorescenční korelační spektroskopie pro stanovení koncentrace uvolňující se látky. Práce přináší dobrý základ pro další rozvoj problematiky teplotně senzitivních nosičových systémů.

S prací a přístupem studenta jsem spokojen, práci doporučuji k obhajobě a navrhuji hodnocení stupně A/výborně.
Evaluation criteria Grade
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Závěry práce a jejich formulace A
Využívání konzultací při řešení práce A
Celkový přístup k řešení úkolů A
Splnění požadavků zadání A
Studium literatury a její zpracování A
Využití poznatků z literatury A

Grade proposed by supervisor: A

Reviewer’s report
Ing. Ivana Málková

Student Richard Struhár předkládá bakalářskou práci na téma přípravy a charakterizace teplotně citlivých liposomů. Práce je logicky členěna a jednotlivé kapitoly na sebe dobře navazují.
V teoretické části se student seznamuje nejdříve s fosfolipidy, na které navazuje kapitola o liposomech zahrnující informace o jejich struktuře, fyzikálně-chemických vlastnostech nebo např. výhodách a limitacích. Následují kapitoly zaměřené na teplotně citlivé liposomy a využití lysolipidů v těchto systémech. Nejsou opomenuty ani kapitoly o různých možnostech přípravy liposomů a jejich následné charakterizace. S ohledem na míru využití fluorescenčních technik v experimentální části sice v kapitole 1.6 výslovně nepostrádám obecnou teorii fluorescence jako je např. Perrin–Jabłonskeho diagram, ale ocenila bych, kdyby se student více rozepsal o anisotropii fluorescence s ohledem na její komplexnost. Zároveň mi chybí zmínka o rozdílu mezi použitými sondami DPH a TMA-DPH.
Druhou velkou kapitolou je shrnutí současného stavu, která je dlouhá jeden a půl stránky. V této části chci ocenit, že student využil nejaktuálnější publikace k danému tématu se zaměřením na možnost využití teplotně citlivých liposomů k léčbě onkologických a chronických onemocnění.
Experimentální část detailně popisuje jednotlivé kroky přípravy vzorků a jejich charakterizace, jak při hledání nejvhodnějšího složení liposomálních systémů, tak i u následných enkapsulačních experimentů. Jednotlivé kroky na sebe logicky navazují a je srozumitelné, jak student ve své laboratorní práci postupoval. Trochu mě překvapuje, že stabilita systémů byla určována pouze z měření velikosti liposomů a indexu polydisperzity, bez zahrnutí hodnot zeta potenciálu.
Kapitola Výsledky a diskuse shrnuje všechny dosažené výsledky jednotlivých experimentů. V této části práce je fotografie připravených vzorků po hydrataci tenkého filmu, ale chybí fotografie po následné extruzi. Toto vizuální porovnání bych osobně v práci ocenila. V tabulkách 2, 5 a 7 nejsou uvedené chyby měření s ohledem na uvedené průměrné hodnoty. Z textu vyplývá, že enkapsulační experimenty nebyly jednoduše proveditelné a zahrnovaly využití pokročilých analytických metod jako je fluorescenční korelační spektroskopie, se kterými se přesto student velmi dobře vyrovnal.
Celkově je práce velmi dobře formulovaná a srozumitelná, s minimem překlepů. Student v práci splnil všechny body zadání a prokázal svou schopnost jak vyhledávání a práce s relevantními zdroji, tak práce v laboratoři.

Práci doporučuji k obhajobě a navrhuji hodnocení stupně A – výborně.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Logické členění práce A
Kvalita zpracování výsledků B
Interpretace výsledků, jejich diskuse B
Využití literatury a její citace A
Úroveň jazykového zpracování A
Formální úroveň práce – celkový dojem A
Závěry práce a jejich formulace A
Topics for thesis defence:
  1. Můžete popsat podmínky a podstatu měření anisotropie fluorescence? Lze jakýkoliv systém měřit libovolnou fluorescenční sondou? Proč jste použil zrovna sondu DPH a její derivát TMA-DPH?
  2. S ohledem na literaturu použitou v rešerši, je možné říci, že lokální teplota v blízkosti nádorových buněk je dostatečně odlišná, aby teplotně citlivé systémy uvolnily svůj obsah právě v cílových místech? Řešily tyto studie lokální rozdíly mezi teplotou vnitřních orgánů a periferní teplotou, zahrnuly faktory ovlivňující tělesnou teplotu?
  3. Pro enkapsulační experimenty jste zvolil vzorek označený C2, který nebyl elektrostaticky stabilizován, a proto měl hodnotu zeta potenciálu blízkou 0 mV. Probíhaly u tohoto vzorku nějaké dlouhodobé stabilitní testy za využití např. DLS a ELS?

Grade proposed by reviewer: A

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová