Master's Thesis

Study of interactions between mutant forms of the p53 tumor suppressor and various DNA structural motifs

Final Thesis 1.95 MB

Author of thesis: Ing. Blanka Sitková

Acad. year: 2025/2026

Supervisor: prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D.

Reviewer: Ing. Xenie Hájková, Ph.D.

Abstract:

The p53 protein is one of the most extensively studied proteins and is mutated in more than 50 % of human cancer diseases. These mutations can alter its function, leading to both loss and gain of function, which subsequently affects various cellular processes. The experimental part of this thesis focuses on the study of the p53 protein and its mutant variants R175H and R273H in terms of their interactions with non-canonical DNA structures, particularly G-quadruplexes and cruciform structures. It was demonstrated that both the wild-type and mutant forms of p53 are capable of binding to these structures. Atomic force microscopy further revealed that
the C-terminal domain influences the binding of p53 to the studied DNA structures. The transcriptional activity of selected mutant proteins was analyzed using luciferase reporter assays. Under in vitro conditions in the yeast Saccharomyces cerevisiae, no significant changes in transcriptional activity of the studied proteins were observed.

Keywords:

p53, G-quadruplex, binding properties, mutp53, EMSA, AFM, transcriptional activities of mutp53

Date of defence

01.06.2026

Result of the defence

Defended (thesis was successfully defended)

znamkaAznamka

Grading

A

Process of defence

1. Studentka seznámila členy komise s náplní a cílem diplomové práce. 2. Byly přečteny posudky na diplomovou práci. 3. Studentka akceptovala všechny připomínky oponentky a na všechny otázky odpověděla v plné šíři. Diskuse: doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. Uvádíte barevné zóny u afinitní chromatografie, můžete to objasnit? Uvádíte 3D strukturu proteinu, jakým způsobem byla určena tato 3D struktura? prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. V práci uvádíte použití antibiotik, z jakého důvodu byla použita? Byla použitá antibiotika bakteriocidní nebo bakteriostatická? Jaký je mezi tím rozdíl? Studentka odpověděla na všechny doplňující otázky členů komise, které byly v průběhu diskuse k dané problematice vzneseny. V diskusi studentka prokázala výbornou orientaci v dané problematice. Po diskusi následovalo hodnocení závěrečné práce. Diplomantka prokázala nejen výborné odborné znalosti, ale i schopnost samostatné prezentace dosažených výsledků.

Language of thesis

Czech

Faculty

Fakulta chemická

Department

Institute of Food Science and Biotechnology

Study programme

Chemistry of Natural Products (NKCP_CHPL)

Composition of Committee

prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. (předseda)
prof. Ing. Stanislav Obruča, Ph.D. (místopředseda)
doc. Ing. Pavel Diviš, Ph.D. (člen)
prof. Ing. Adriána Kovalčík, Ph.D. (člen)
doc. Ing. Eva Vítová, Ph.D. (člen)
prof. RNDr. Iva Burešová, Ph.D. (člen)

Supervisor’s report
prof. Mgr. Václav Brázda, Ph.D.

Diplomová práce Blanky Sitkové vykazuje velmi nízkou míru shody s jinými dokumenty (pod 5 %), což svědčí o vysoké originalitě zpracování. Práce je zaměřena na studium interakcí proteinu p53 a jeho mutantních forem s nekanonickými strukturami DNA, zejména G kvadruplexy a křížovými strukturami, a kombinuje rozsáhlou teoretickou část s precizně provedenou experimentální částí. Studentka úspěšně zvládla celou řadu metodik zahrnující izolaci a purifikaci proteinů, EMSA, AFM i luciferázové reportérové testy a prokázala schopnost samostatného řešení komplexních úloh a interpretace výsledků. Bylo prokázáno, že všechny studované varianty p53 se vážou na různé DNA struktury a že významnou roli v těchto interakcích hraje C terminální doména proteinu, přičemž mutantní formy vykazují odlišnou afinitu i funkční aktivitu. Výsledky jsou přehledně prezentovány a diskutovány v kontextu současné literatury a přinášejí cenné poznatky pro pochopení regulační role p53 a jeho mutací v nádorové biologii. Práce je metodicky kvalitní, logicky strukturovaná a má potenciál dalšího využití v oblasti studia protein-DNA interakcí. Práce splňuje všechny požadavky kladené na diplomovou práci, doporučuji ji k obhajobě a navrhuji hodnocení výborně (A).
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Studium literatury a její zpracování B
Využití poznatků z literatury A
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Závěry práce a jejich formulace A
Využívání konzultací při řešení práce B
Celkový přístup k řešení úkolů A

Grade proposed by supervisor: A

Reviewer’s report
Ing. Xenie Hájková, Ph.D.

Diplomová práce Bc. Blanky Sitkové se zabývá studiem interakcí mutantních forem nádorového supresoru p53 s různými strukturními motivy DNA, konkrétně G-kvadruplexy a křížovými strukturami. Studentka prokázala schopnost orientace v odborné literatuře i zvládnutí řady experimentálně náročných metod, jako jsou elektroforetické testy posunu mobility, mikroskopie atomárních sil či luciferázové reportérové testy v kvasinkových systémech.
Práce je logicky členěna a jednotlivé kapitoly na sebe vhodně navazují. Teoretická část poskytuje přehledné shrnutí problematiky struktury a biologické role proteinu p53 i nekanonických struktur DNA. Experimentální část je zpracována přehledně a výsledky jsou vhodně doplněny fotkami gelů, mikroskopickými snímky a grafy. Oceňuji zejména propojení více experimentálních přístupů a snahu interpretovat výsledky v kontextu publikovaných studií.
K práci mám pouze několik drobných připomínek. Teoretická část je místy velmi detailní a občas sklouzává k popisnosti. V obrázku 5.3.1 se (A) a (B) jeví jako totožné, což pravděpodobně nastalo nedopatřením při finalizaci dat. Bylo by vhodné tuto skutečnost objasnit při obhajobě. Z jazykového hlediska se v práci objevují drobné nepřesnosti (př. nekonzistentní značení – BL21 Codon+ vs. BL21-CodonPlus, byla odebráno, blotovací roztok vs. blotovací pufr), které však nijak nesnižují celkovou odbornou úroveň práce.
Celkově hodnotím diplomovou práci jako velmi kvalitní, odborně přínosnou a experimentálně rozsáhlou. Diplomovou práci doporučuji k obhajobě a navrhuji hodnocení stupněm A.
Evaluation criteria Grade
Splnění požadavků zadání A
Logické členění práce A
Kvalita zpracování výsledků A
Interpretace výsledků, jejich diskuse A
Využití literatury a její citace A
Úroveň jazykového zpracování A
Formální úroveň práce – celkový dojem A
Závěry práce a jejich formulace A
Topics for thesis defence:
  1. Čím si vysvětlujete rozdíly ve vazebných vlastnostech mutantů R175H a R273H vůči studovaným DNA strukturám?
  2. Jaké jsou výhody a limity použití kvasinkového modelového systému při studiu transkripční aktivity mutantních forem p53?

Grade proposed by reviewer: A

Responsibility: Mgr. et Mgr. Hana Odstrčilová